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蛍光検出・標識

LigandLink™ Universal Labeling

細胞内で特異的かつフレキシブルにタンパク質を標識します

LigandLink™ Universal Labeling* は in vivoで目的のタンパク質を蛍光標識することができます。シンプルに細胞内で目的タンパク質をLigandLink融合タンパク質として発現させ, 培養液中にLigandLink Label を加えます。タグの特性を変えるには, 加えるLigandLink Labelの種類を変えるのみです。そのため目的タンパク質をコードする遺伝子を1回クローニングするだけで, 必要に応じて様々なタグで標識することができます。

*特許出願中

 
Name Format Cat No. 価格 (税抜)  
LigandLink™ pLL-1 Kit 1 kit 34001 ¥55,000 Buy Now
LigandLink™ pLL-1-NFκB p65 Kit 1 kit 34004 ¥55,000 Buy Now
LigandLink™ pLL-1-p53 Kit 1 kit 34005 ¥55,000 Buy Now
LigandLink™ pLL-1-STAT1 Kit 1 kit 34006 ¥55,000 Buy Now
LigandLink™ Fluorescein Label 300 rxns 34101 ¥84,000 Buy Now
LigandLink™ Hexachlorofluorescein Label 300 rxns 34104 ¥84,000 Buy Now
LigandLink™ Covalent pLL-1 Kit 1 kit 34007 ¥55,000 Buy Now
LigandLink™ Covalent Fluorescein Label 300 rxns 34107 ¥84,000 Buy Now
LigandLink™ Covalent Hexachlorofluorescein Label 300 rxns 34108 ¥84,000 Buy Now

LigandLink™の利点

  • 細胞内におけるタンパク質の標識 – LigandLink Labelは細胞透過性です。
  • クローニング時間の短縮 – 様々なベクターを使用せず1回クローニングすれば, 異なったLigandLink Labelを使用して標識する事ができます。
  • 低分子標識 – LigandLink Labelは目的タンパク質の性質を変えません。

LigandLink™ の用途

  • タンパク質局在および輸送研究
  • タンパク質:タンパク質相互作用
  • タンパク質の捕獲

Pre-made translocation vectors

シグナル伝達経路では, いくつかの特定の刺激による活性化により, 細胞の至る所でのタンパク質移動が起こります。のタンパク質を標識するため, 細胞内の移動現象のような研究に適しています。さらに簡便な研究を行うことができる, NFκB p65 のようないくつかの転写因子をクローニングしたpLL-1ベクターも用意しているため, 研究対象の哺乳細胞にすぐにトランスフェクションすることができます。

 
図4: LigandLink pLL-1ベクター

使用しやすいベクターを用意しました

LigandLinkベクター, pLL-1は簡単に使用できるよう設計されました。特徴として, eDHFR融合タンパク質を高発現するようCMVプロモーターを持ち, カナマイシンで安定発現株をセレクションすることができます。マルチプルクローニングサイト(MCS:multiple cloning site)はどのような方法を用いても容易に行う事ができるよう設計されています。多数の一般的な制限酵素サイトに加えて, MCSには3´ 末端に向かってeDHFR遺伝子とそれぞれ異なったフレームで, 3個の平滑末端制限酵素サイトも含まれます。これにより, 様々なPCRや制限酵素を用いてクローニングすることができます。

簡単に標識を変えることができます

コリプレッサーやコアクチベーター相互作用解析はタンパク質機能を理解する上で重要な要素となります。しかし, 複数のタンパク質が交差する相互作用の解析は, 時間もコストもかかります。これはそれぞれの相互作用するタンパク質を異なったFP融合ベクターにクローニングする, もしくは一次抗体を複数の色素で標識する必要があるためです。この問題を解決するために, 目的タンパク質に相互作用するタンパク質に応じて簡単に標識を置き変えることができるよう, 2種類のLigandLink Labelを用意しました。そのため時間もコストも抑えることができます。

現在の細胞生物学研究では, GFP(green fluorescent protein)やその類似体が使用されます。しかし, 生物学的に蛍光タンパク質(FPs:fluorescent proteins)はそれらの特有な性質のために使用が制限されます。例えば, FPsは量子収量が低いため, それらのスペクトル特性を目的の解析法に適用させることは困難です。

蛍光色素は様々なフォーマットで使用でき, 望ましいスペクトル特性を簡単に設計することができるため, 生物学的FPsに変わる有用な色素です。しかし蛍光色素は合成分子のため, 生体内で特異的なタンパク質を標識するための一般的なツールとしての使用は不可能とされてきました。

LigandLink™ の使用法

LigandLinkでは, 目的遺伝子をpLL-1ベクターのジヒドロ葉酸還元酵素(eDHFR:E. coli dihydrofolate reductase)遺伝子とインフレームでクローニングします(図4)。ベクターを哺乳細胞にトランスフェクションすると, 融合タンパク質を発現します。トランスフェクション24時間後,実験に適したLigandLink Labelを培地に加えることにより, 簡便に目的タンパク質を標識することができます(図1)。細胞や, 標識の特性にもよりますが, 最短10分間で標識した細胞を観察することができます。

図1:LigandLinkを使用した目的タンパク質の標識

目的遺伝子をpLL-1ベクターにジヒドロ葉酸還元酵素(eDHFR)遺伝子とインフレームでクローニングする。細胞にトランスフェクション後, 目的タンパク質はeDHFRとの融合タンパク質として発現する。培地に細胞透過性のLigandLink Labelを加えるとすぐに, 融合タンパク質と特異的に結合して標識される。

eDHFRタンパク質が融合タンパク質のパートナーとして選ばれた理由は, 小さい単量体タンパク質(18 kDa, GFPの場合は27 kDa)で, リガンドであるトリメトプリム(TMP:trimethoprim )に高い結合性を示すためです。TMPはE. coliが形成するDHFR (KI = ~1 nm)に高い結合性を示しますが, 内在性のDHFR (KI = ~4 µm)に対しては低い結合性を示します。これはTMPが哺乳類のタンパク質とは相互作用しない, 葉酸生産に関与する細菌の酵素を特異的に阻害する抗生物質のためです。その結果, ターゲットでない哺乳類のタンパク質へのLigandLink Labelの結合は最小限に抑えられ, バックグラウンドは非常に低くなります。加えて, TMPはeDHFRへの親和性や特異性を保ったまま数種のタグを運搬するよう誘導化されます。

LigandLink Universal Labeling技術はeDHFRとさまざまな機能をもつリガンド-レセプターとして数種のTMP誘導体を用います。細胞透過性のLigandLink Labelには赤と緑の色素(図2 & 3)があります。

 
図2: LigandLink Fluoresceinによる核局在eDHFRの標識

核局在配列をpLL-1にクローニングし, CHO細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション24時間後, 5 µM LigandLink Fluoresceinを加え, 10分後撮影した。

 
図3: LigandLink Hexachlorofluoresceinによる細胞膜局在eDHFRの標識

Lynのミリストイル化/パルミトイル化配列をpLL-1にクローニングし, CHO細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション24時間後, 10 nM LigandLink Hexachlorofluoresceinを加え, 2時間後撮影した。

参考文献

  1. Miller, L.W. et al. (2005) Nature Methods 2(4): 255-257.

The LigandLink™ Universal Protein Labeling System has been successfully used in the following publications:

Contents & Storage

Each LigandLink Kit contains 20 µg of vector and 100 reactions of LigandLink Fluorescein Label. Each reaction of LigandLink Label is sufficient to label a single well of a 96-well plate. Store at 4°C. All reagents are guaranteed stable for 6 months when stored properly.