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エピジェネティクス・クロマチン

クロマチン免疫沈降キット ChIP-IT® Express

磁気ビーズを用いた迅速、簡便、再現性の高いChIP アッセイ

ChIP-IT® Express Kitは従来法であるアガロースビーズに代わり、プロテインGをコートした磁気ビーズを使用することにより、ChIPアッセイをわずか1日で行うことを可能にしました。ChIP-IT Express Kitは、ChIPアッセイの時間や労力を減らすだけでなく、再現性の高い結果を得ることができます。

アクティブ・モティフ社は、試料や目的に合ったChIPキットおよびChIPアクセサリーも提供しています:

さらに、アクティブ・モティフ社の Epigenetic Services ChIP, ChIP-Seq およびゲノムワイドなデータ創出および解析受託サービスです。

ChIP-IT Express 日本語簡易プロトコールはこちらをご覧ください>

ChIP-IT Express Enzymatic 日本語簡易プロトコールはこちらをご覧ください>

 

 
Name Format Cat No. 価格 (税抜)  
ChIP-IT® Express 25 rxns 53008 ¥87,000 Buy Now
ChIP-IT® Express Enzymatic 25 rxns 53009 ¥95,000 Buy Now
ChIP-IT® Express Shearing Kit (included in 53008) 10 rxns 53032 ¥40,000 Buy Now
ChIP-IT® Express Enzymatic Shearing Kit (included in 53009) 10 rxns 53035 ¥48,000 Buy Now
ChIP-IT® Protein G Magnetic Beads (included in 53008 & 53009) 25 rxns 53014 ¥46,000 Buy Now
Siliconized Tubes, 1.7 ml 25 tubes 53036 ¥12,000 Buy Now

磁気ビーズを用いて迅速に解析

ChIP-IT Express は従来のChIPアッセイでは時間を要していた, いくつかのステップを削減または省略することができるようになりました。磁気ビーズは, 従来のアガロースビーズと比較してバックグラウンドが非常に低いため, プレクリアやブロッキングを行う必要がありません。また磁気ビーズは洗浄の際, マグネットバーまたはマグネットスタンドを使用するため, 遠心分離の必要がなく洗浄が簡便になります。さらに洗浄回数も8回から3回に短縮できるため, 操作時間を大幅に短縮することができます。また溶出バッファーの改良により, DNA精製を行う必要がなくなりました。これにより時間短縮だけでなく, 操作を最小限に抑えることにより精製時に生じるDNAのロスを防ぐことができ, 試料間の「ばらつき」を抑えることができます。

改良バッファーによりさらにバックグランドを抑えます

磁気ビーズやマグネットバーを用いることにより, ChIPアッセイを迅速かつ簡便に行うことができるだけでなく, キットに含まれる全てのバッファーについても最適化を行っているため, 良好な結果が得られます。溶出バッファーと脱クロスリンクバッファーはバックグラウンドを抑えることができるよう最適化しており, 小さな違いも検出できるようになります。バックグラウンドを抑えることで, より少ない細胞数でのChIPアッセイも可能となります (概要 図2参照)。  

バックグラウンドを抑えることに加え, ChIP-IT ExpressではDNA精製の必要がなくなりました。またビーズからのDNA溶出と脱クロスリンクを同時に行うことができるようになりました。このような簡便なプロトコルのため, 同時に複数試料のChIPアッセイが可能です。ChIP-IT Expressはマルチチャンネルピペッターを用いてPCRチューブ内で反応を行うことができるため, ハイスループットChIPアッセイにも最適です(図1 & 2).

図 1 & 2: ChIP-IT Expressを用いた複数資料のChIPアッセイ

磁気ビーズ洗浄ステップで上清を除去する際, 磁気ビーズはマグネットバー側のチューブ壁面に付着するため, 洗浄ステップは迅速かつ簡便である。ペレットを乱すことがなく試料のロスも防ぐ。そのためマルチチャンネルピペッターを使用してPCR 8連チューブで複数の試料を同時処理することが可能である。

強力なマグネット

ChIP-IT Expressには強力なマグネットバーが含まれます。このマグネットバーを使用する際, 通常のピペットチップボックスをマグネットスタンドとしてご使用頂けます。エッペンドルフチューブをご使用の際はP1000のチップボックス(図3), PCR 8連チューブをご使用の際はP200チップボックス(図1 & 2)をご使用下さい。Ambion(Applied Biosystems) 社製 (図4) やPromega社製のマグネットスタンドもご使用頂けます。

図3: 標準的なピペットチップボックスを使用したマグネティックChIPアッセイ

ChIP-IT Expressには強力なマグネットバーが含まれる。プロテインGをコートした磁気ビーズの洗浄ステップでピペットチップボックスをマグネットスタンドとして使用可能である。

図4: Ambion社製のマグネットスタンドを使用した場合

Ambion社製やPromega社製のマグネットスタンドを使用することも可能である。

ソニケーションまたは酵素処理の選択可能

ChIPアッセイを成功させるためにはクロマチンを 200-1000 bp に断片化する必要があります。従来クロマチン断片化はソニケーションを用いて行われてきました。ソニケーションは有効な方法ですが, 溶液の過熱や乳化などが発生することもあり, 条件検討が難しく再現性に問題がありました。再現性はソニケーターの品質にも大きく左右されるため, 高価なソニケーターが必要となります。このような問題を解決するために, アクティブ•モティフ社では酵素を用いてクロマチン断片化を行う方法を開発しました。以前から発売しているアガロースビーズを用いたChIP-IT シリーズでもクロマチン断片化をソニケーションを行うChIP-IT Kitと, クロマチン断片化を酵素で行う ChIP-IT Enzymatic をご用意しています。 クロマチン断片化試薬のみをご希望の方は こちら をクリックして下さい。さらにソニケーションにより予めクロマチンを断片化処理した Ready-to-ChIP Chromatinもご用意しています。ChIP-ITシリーズキットおよびコントロールと併せて断片化処理済みクロマチンを使用することで, 使用する全ての試薬がChIPアッセイに最適となります。そのため研究者ご自身で用意した抗体およびプライマーがChIPアッセイに適しているかどうかを簡便に判断することができます。

ChIP-IT Control Kit と ChIP用抗体

以前から発売しているアガロースビーズを用いた ChIP-IT Kitにはヒト試料用のポジティブコントロールおよびネガティブコントロールが付属しています。コントロールを使用することにより, 実験のトラブルシューティング, 得られた結果の解釈, 抗体の有効性の評価が簡便となります。ChIP-IT Expressにはコントロールが付属されていないため, ヒト, マウス, ラットから目的種の ChIP-IT Control Kit を選択して下さい。またアクティブ•モティフ社では ChIP用抗体もご用意しています。これらのChIP用抗体は全てのChIP-ITシリーズでご使用頂けます。

クロマチン免疫沈降 (ChIP: Chromatin immunoprecipitation)はタンパク質とDNAの結合を検出するための強力なツールであり, 免疫沈降の特異性と高感度なPCR解析を組み合わせたアッセイです。しかしChIPアッセイは技術的に難しく, 結果の解釈も困難とされています。これらの問題を解決するため, ChIP-ITシリーズではChIPアッセイで検証済の抗体, 試薬およびコントロール等を提供しています。またChIP-ITシリーズは改良を重ねることにより, プロトコルの簡便化とバックグラウンドの減少に成功しました。 

 
ChIP-IT Express schematic
 
図1: ChIP-IT Expressを用いたクロマチン免疫沈降の模式図
 

ChIPアッセイではまず細胞を固定し, タンパク質とDNA相互間を架橋します。その後ソニケーションまたは酵素処理によりクロマチンを断片化します。次にDNA - タンパク質複合体を目的のタンパク質に特異的な抗体を用いて免疫沈降します。免疫沈降後, ビーズを洗浄しますが, この時はまだ, DNA-タンパク質複合体は架橋されたままです。ビーズ洗浄後は, Proteinase K処理をしてタンパク質を除去します。以前から発売しているアガロースビーズを用いたChIP-IT Kitではこの後, キット付属のカラムでDNAを精製します。このDNA精製ステップはChIP-IT Express (図1)では必要ありません。最後に得られたDNAを用いて, 目的のタンパク質がどの遺伝子に結合しているかを解析します。

ChIP-IT® Kit の利点

  • コンプリートキット – 必要な試薬とコントロールが含まれます
  • ヒストンやヒストン修飾だけでなく, DNA - タンパク質複合体を直接解析することができます。
  • ゲノムワイドなプロファイリングまたは遺伝子特異的なプライマーを用いたPCR解析が可能です。
  • 試薬やプロトコルを最適化する必要がありません。
  • フェノール / クロロホルム抽出は不要 – 従来のChIP-IT KitにはDNA精製カラムが含まれます。ChIP-IT ExpressではDNA精製の必要がありません。

従来ChIPアッセイは, アセチル化ヒストンのようなクロマチン構成因子に対する抗体を使用して行われてきました。この場合, プロモーターの転写活性についての情報は得られますが, 目的のプロモーターにどの転写因子が結合するかは明らかになりません。対照的に, 転写因子特異的な抗体を用いるChIPアッセイは転写因子とDNAの相互作用を直接解析することができます。しかしながらChIPアッセイは技術的に難しく, 多くのバッファー, 阻害剤およびブロッキング試薬を用意する必要があります。それに加えて結果を証明するためには, ChIPアッセイで使用できることが確認されている抗体, コントロールおよびプロトコルなしでは困難です。このような問題を解決するため, また転写因子とヒストン両方のChIPアッセイを可能にするため, アクティブ•モティフ社ではChIP-ITシリーズを開発しました。ChIP-ITシリーズではChIPアッセイに必要な試薬全てをご用意しています(図2)。

 
 
図2: ChIP-IT Expressを使用した少量試料でのChIPアッセイ

免疫沈降後のDNAを用いたPCR解析。この図からChIP-IT Express KItの有効性が分かる。一般的にChIPアッセイには2百万個の細胞が必要とされるが, ChIP-IT Expressでは10万個またはそれ以下の細胞数でも, 良好な結果が得られている。

HeLa細胞を1% ホルムアルデヒドを用いて10分間固定し,  クロマチンをソニケーションにより断片化した。100,000個および750,000個の細胞から得られたクロマチンを用いてduplicateでChIPアッセイを行った。免疫沈降には抗RNA pol II抗体およびNegative Control IgGを用いた。免疫沈降後, GAPDHポジティブコントロールプライマーを用いてPCR反応を36サイクル行った (これらの抗体やプライマーはChIP-IT Control Kit – Humanに含まれます。Mouse, Rat用のControl Kitにもそれぞれ最適の抗体とプライマーが含まれます)。 PCR反応液をそれぞれ10 µl を1%アガロースゲルで電気泳動し, エチジウムブロマイドで染色後, 撮影した。抗RNA pol II抗体で免疫沈降し, GAPDHプライマーを用いてPCR反応を行った試料は, Negative Control IgGで免疫沈降し, 同プライマーでPCR反応を行った試料よりもPCR産物が多いことが分かる。これらの結果から, 抗RNA pol II抗体を用いたChIPアッセイではGAPDHプロモーターDNAを濃縮することができるが, negative IgGでは濃縮されないことが分かる。

Flexible ordering options

The ChIP-IT Express and ChIP-IT Express Enzymatic Kits include Protein G Magnetic Beads and the shearing components found in the ChIP-IT Shearing or Enzymatic Shearing Kits, respectively. However, depending on how many ChIPs you perform with each sample of sheared chromatin, you may run out of shearing components before using up all of the immunoprecipitation components in the ChIP-IT Express Kits. For this reason, the ChIP-IT Sonication & Enzymatic Shearing Kits and Protein G Magnetic Beads are also sold separately.

ChIP-IT Express Kits provide sufficient components to perform 25 ChIP reactions. Sufficient shearing components are included to optimize shearing conditions and then make 5 preparations of sheared chromatin from three 15 cm plates (4.5 x 107 cells); each of these chromatin preparations yield enough material to perform approximately 6 ChIP reactions. We recommend that you also purchase whichever ChIP-IT Control Kit is appropriate for your sample type, as using proven controls helps in troubleshooting, interpreting your results and validating antibodies for use in ChIP.

Contents & Storage

Protein G Magnetic Beads, Bar Magnet, Sticky Dots, Shearing Buffer (or Digestion Buffer and Enzymatic Shearing Cocktail), ChIP Buffers 1 and 2, Elution Buffer, Reverse Cross-linking Buffer, Wash and 10X PCR Buffers, 10X PBS, 10X Glycine, 1X Lysis Buffer, Protease Inhibitor Cocktail, PMSF, EDTA, Proteinase K, Proteinase K Stop Solution and RNase A. Reagent storage conditions vary from room temperature to -20°C. Please download a manual for complete kit specifications and storage conditions. All reagents are guaranteed stable for 6 months when stored properly.