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遺伝子発現制御

TransAM® 転写因子活性測定ELISA

sensitive, quantitative ELISAs for transcription factor activation

転写因子は遺伝子発現を調節するDNA結合タンパク質で,特定のDNAシークエンスと結合するドメインと転写効率に影響を与えるドメインが存在します。転写因子は、特定のタンパク質残基のリン酸化によって、あるいは抑制タンパク質の結合によって活性化されます。転写要因の定量は、細胞分化、脳機能解析、免疫反応、炎症および様々な疾病状態に関連する細胞機能の研究に不可欠です。

TransAM® Kitは哺乳動物細胞や組織を用いて転写因子研究を行うことができる,ラジオアイソトープ不要で高感度なELISAベースのアッセイです。なおTransAM® Kitは右のような製品ラインナップをご用意しています。詳細はそれぞれの製品名をクリックしてご覧下さい。

または製品一覧はこちらから

簡易プロトコルはこちらから

 

Flow chart of the TransAM DNA binding transcription factor ELISA method for measurement of activated transcription factors
TransAM® の操作法

細胞抽出物に含まれる活性型転写因子が、ウェルに固定されたオリゴヌクレオチドに結合します。一次抗体、二次抗体、発色試薬を順次加え、活性型転写因子を測定します。

TransAM® の利点

これまで転写因子の研究はウェスタンブロット,レポーターアッセイおよびゲルシフトアッセイにて行われてきました。しかし,いずれの手法も実験に多大な時間を要し,ハイスループット解析ができず,しかも半定量的な結果しか供給できません。TransAMアッセイは,従来のゲルシフトアッセイよりも最大で100倍高感度 な結果が得られるELISAに基づいたアッセイで,ラジオアイソトープ を必要とせず,ハイスループット対応で再現性のある結果が得られます。

TransAM® Kitの特長

  • ゲルシフトアッセイより最大で100倍高感度です。
  • ラジオアイソトープ不要でゲル電気泳動の必要がありません。
  • 特異性の高いアッセイで,3時間以内に定量的な結果が得られます。
  • 比色定量(吸光度測定)により簡単に解析できます。
  • ハイスループット対応です。

TransAM® Kitの使用法

それぞれのTransAM® Kitには特異的な二本鎖オリゴヌクレオチドが 96ウェルプレートに固定されています。96ウェルプレートに核抽出物 または細胞抽出物を添加すると,目的の転写因子のコンセンサス結合部位がオリゴヌクレオチドと結合します。目的の転写因子に特異的 に結合する一次抗体を加えた後,HRP標識二次抗体,発色試薬を順次加えます(図1)。その後,比色変化をマイクロプレートリーダにより測定します。その値は転写因子量に正比例するため,転写因子活性を高感度かつ定量的に測定することができます。

 

The TransAM® transcription factor ELISA advantage

Historically, transcription factor studies have been conducted using gelshift, Western blot and reporter plasmid transfections, which are time-consuming, do not allow for high-throughput and provide only semi-quantitative results. TransAM assays are up to 100 times more sensitive than gelshift techniques, and can be completed in less than 5 hours. Because TransAM is an ELISA-based assay*, there is no radioactivity, and the high-throughput stripwell format enables simultaneous screening of 1-96 samples. Inconsistencies due to variable reporter plasmid transfections are eliminated, along with the need to construct stable cell lines.

How TransAM® transcription factor ELISAs work

The TransAM format is perfect for assaying transcription factor binding to a consensus-binding site. TransAM Kits contain a 96-stripwell plate to which the consensus-binding site oligo has been immobilized. Activated nuclear extract is added to each well and the transcription factor of interest binds specifically to this bound oligonucleotide. A primary antibody specific for an epitope on the bound and active form of the transcription factor is then added followed by subsequent incubation with secondary antibody and Developing Solution to provide an easily quantified, sensitive colorimetric readout (Figure 1).

Flow chart of the TransAM DNA binding transcription factor ELISA method for measurement of activated transcription factors
Figure 1: Flow chart of the TransAM process.

Activated transcription factor in the cell extract binds to the consensus-binding site on the oligo immobilized in the well. Incubation with the supplied primary and secondary antibodies specifically quantifies the amount of activated transcription factor.

* Technology covered under EAT-filed patents and licensed to Active Motif. Use of TransAM in NFκB-related drug discovery may be covered under U.S. Patent No. 6,150,090 and require a license from Ariad Pharmaceuticals (Cambridge, MA, USA).