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完全ガイド：ATAC-Seqの理解と使用法

By Stefan Dillinger, Ph.D.

February 9, 2021

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クロマチン免疫沈降（ChIP）およびRRBS (Reduced Representation Bisulfite Sequencing)のような方法は、研究者がゲノムワイドにエピジェネティックな修飾を調べることを容易にしました。しかし、これらの手法の潜在的な限界の1つは、自分の実験系においてどのようなエピジェネティックなメカニズムが働いているかを、あらかじめ理解している必要があることです。

ATAC-Seq法は、原因となるメカニズムに関わらず、ゲノム全体にわたるクロマチンへのアクセシビリティーに関する情報を研究者にもたらしてこの問題を解決します。多くの研究者は、サンプル間のクロマチンアクセシビリティーの変化を同定するための最初のスクリーニング的アプローチとしてATAC-Seqを利用し、その結果に基づいて次の実験の着目点を絞ることができます。

この記事では、ATAC-Seqとは何か、歴史、その仕組みとATAC-Seqによって可能になったいくつかの発見について説明します。

ATAC-Seqとは何か?

ATAC-Seqは、Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing の略です。ATAC-Seq法は、高活性改変型Tn5トランスポゼースを用いた次世代シーケンサー(NGS: Next-Generation Sequencer)のライブラリー構築に依存します。トランスポゼースはヌクレオソームの緩んだゲノム領域でのみDNAと反応することが可能であるため、NGSアダプターが組み込まれたトランスポゼースを混ぜることにより、オープンクロマチン領域選択的なクロマチンの断片化とアダプターによる標識を同時に行えます。構築されたライブラリーはNGSによりシーケンス可能であり、バイオインフォマティクスを用いてオープンな、すなわちアクセシブルなクロマチン領域が解析されます。

同様なクロマチンの特徴を調べるFAIRE-SeqまたはDNase-Seqなどの他の手法と比較したATAC-Seqの主な利点は、アッセイに必要な細胞数が少ないこと、ChIP-Seqのように特定の標的タンパク質に対する抗体が不要であること、およびプロトコールが比較的単純であることです。

ATAC-Seqの歴史

ATAC-Seq法は2013年にNature Methods誌においてJason Buenrostroを筆頭著者とするHoward ChangおよびWilliam Greenleefらスタンフォード大学のグループから初めて発表されました。当時、彼らはオープンクロマチン、ヌクレオソームの配置、転写因子の占有を研究するために用いられていた手法に代わる方法を探していました。当時の方法はどれも、これら3つの研究を一つのアッセイで同時に評価できない他、実験材料となる細胞や組織が大量に必要であったり、複雑で時間のかかるプロトコールが必要であったりといった制限がありました。そこでBuenrostroらはこれらの限界を克服しようと試み、他の手法よりも格段に少ない細胞から、エピジェネティックな特徴の全体像を解析可能な技術を考案しました。

彼らの方法は高活性改変型Tn5トランスポゼースに依存します。当時この酵素は、Epicentre社(後にIllumina社が買収)が開発したNextera法のように、タグメンテーションを基盤とするNGSライブラリー作製法としてすでに利用されていました。タグメンテーション処理は、in vitroにおけるゲノムDNAの断片化と同時にハイスループットシーケンスのためのアダプターを付加することが可能です。そこでBuenrostroらは、in vivoにおいて同様のアプローチをとれば、アダプターの付加は主に、トランスポゼースの立体障害が発生しないオープンクロマチン領域で起こり、トランスポゼースがこの領域に優先的にアクセス可能になると仮定しました。

著者らの概念実証研究で、彼らは500個と5万個の細胞集団から分離された未固定の核を調査しました。得られたデータはDNase-SeqおよびFAIRE-Seqと非常によく似ていましたが、いずれも100万～5,000万個の細胞を必要とします。したがって、ATAC-Seq法は必要なサンプル量の点において従来の方法よりも大幅に改善されたことを示しています。

さらに、トランスポゼースは、NGSアダプターをアクセス可能なDNAに付加するだけなので、ATAC-Seqには付随する利点があります。それは転写因子結合プロファイルだけでなく、ヌクレオソームの位置の高解像度マップを作成するのにも使用できることです。また、比較的簡単な2段階プロトコールは、ATAC-Seqが臨床検体から個別のエピジェネティックな特徴を見いだせる可能性を秘めていることを研究者に示唆しています。

ATAC-Seqの仕組み

前述のように、アクセシブルなクロマチン領域やヌクレオソームの配置を解析するためのDNase-SeqやFAIRE-Seqのような他の手法に対するATAC-Seqの主な利点の一つは格段に少ない細胞数で実行可能なことです（ATAC-Seq：～50,000細胞、他の方法：数百万細胞）。また、過去の方法はATAC-Seqに比べてより面倒ですが、ATAC-Seqは2段階のプロセスが数時間で終了します。

以下に、ATAC-Seqのプロトコールの概要を示しますが、それは細胞調製とトランスポゼース処理の2つの主要パートに分けられます。

細胞調製

まずはじめに、細胞を回収します。ATAC-Seqアッセイで使用する細胞数は、トランスポゼースによる処理においてDNAに対するアダプターの付加と、生じるDNA断片のサイズ分布に影響を与えるため、細胞数を計数することはとても重要です。さらに、細胞が無傷で均質であることに加え、単一細胞レベルに分散させることが必要です。細胞は回収後、純粋な核を得るために非イオン性の界面活性剤で溶解します。

トランスポゼースによる処理

得られたクロマチンは、ATAC-Seqライブラリー調製のためTn5トランスポゼースを用いてシーケンスアダプターが標識され、と同時に断片化されます。ライブラリーは精製後、バーコード用プライマーを用いたPCRにより増幅されます。その結果、ライブラリーはqPCRや次世代シーケンサーにより解析されます。

その他ATAC-Seqにおいて考慮すべき事項

正確な細胞数を使用することはトランスポゼースによる処理で重要です。一般的な推奨数は25,000～75,000細胞です。極端に少ないまたは多い細胞は過剰または不十分な消化となり、質の悪いライブラリーの作製につながります。さらに、細胞の固定や激しい機械的剪断は得られるデータの質の低下につながります。

最近のATAC-Seqの応用とブレークスルー

ATAC‐Seqはその短い2段階プロセスを通して、様々な細胞種とモデル系に適用できることが実証されています。2013年にこの手法が発表されて以来、ATAC-Seqを用いて発表された論文は毎年倍増しています。ここでは、この方法の影響と適用性を示す異なる分野の論文についていくつか記述します。

ATAC-Seqと「がん」

マイアミの研究チームとその共同研究者は、がんエピジェネティクスの成長分野においてATAC-Seqを利用し、ポリコーム抑制複合体1 (Polycomb repressive complex1; PRC1)が乳がんのクロマチン状態に与える影響について調べました。ATAC-Seqの実験は、PRC1複合体を構成するRING1Bの低下が、複数のエンハンサー領域においてクロマチンアクセシビリティーを変化させることを示しました。さらに、RING1Bの欠損はエンハンサー近傍において、約500か所のピークの喪失と、600以上の新たなピークの獲得をもたらしました。モチーフ解析の結果は、ピークの消失したエンハンサー領域にはFOXA1/2結合サイトが含まれ、新規にピークが出現した領域にはCTCF結合サイトが含まれることを示しました。このことは、RING1Bが乳がん細胞において2つの役割をもつこと示しています。

ATAC-Seqを用いた老化の研究

加齢黄斑変性(Age-related macular degeneration; AMD)は、不可逆的な失明へとつながる症状です。この疾患のリスク上昇と関連するいくつかの遺伝子座が知られていますが、エピジェネティックな役割はほとんどわかっていません。

ジョンズホプキンス大学医学部の科学者らは、AMD患者と健常者のゲノムワイドなクロマチンアクセシビリティーを調べるためにATAC-Seqを利用しました。彼らの結果は、初期AMD患者の網膜色素上皮(RPE; retinal pigment epithelium)および進行した患者の網膜においてクロマチンアクセシビリティーが著しく減少していることを示しました。さらなるデータ解析は、特定の転写因子と細胞機能が差次的にアクセシブルなクロマチン領域に豊富であることを示しました。

さらに、彼らはAMDにおける喫煙のような、潜在的な環境による影響について調査しました。最終分化したiPS細胞由来RPE細胞にたばこの煙を処置すると、AMD患者で見られたパターンによく似たクロマチンアクセシビリティーの減少を誘導しました。

著者らは、AMD治療の潜在的な薬剤標的の同定を試み、RNA-Seqデータの解析から、ヒストン脱アセチル化酵素の一種であるHDAC11がAMD患者において過剰発現していることが明らかにして、将来の治療標的となりうると結論付けました。

ATAC-Seqと免疫学

液性免疫応答においてB細胞が成熟する間、B細胞の前駆細胞は、複数の転写因子が協調的に関与するクロマチンの多層的再編を介して大規模に表現型を変化させます。コーネル大学の研究者およびその共著者らはリシン特異的脱メチル化酵素1 (LSD1)のB細胞発達における役割を調べ、最近Nature Immunology誌に発表しました。

研究チームは、胚中心特異的Lsd1 KOマウスからセルソーターで分離した胚中心B細胞におけるオープンクロマチン領域を調べるため、ATAC-Seqを実施しました。その結果、胚中心特異的Lsd1 KOマウスにおいて733か所のアクセシブルなクロマチン領域獲得と、314か所のアクセシビリティー喪失を見出しました。733か所の『開いた』領域に関連した転写活性の増加もありました。ChIP-Seqを含むさらなる実験により、エンハンサーおよびプロモーター停止に重要な転写抑制因子であるBCL6が、LSD1と直接結合してクロマチンにリクルートすること、およびこの相互作用が胚中心B細胞の悪性形質転換を引き起こすのに必要であることを明らかにしました。

細胞分化と発達の研究に用いられるATAC-Seq

細胞の分化と分化系列の決定は、しばしばエピジェネティックなメカニズムによって媒介されます。これにはクロマチン構造の大規模な変化および、一般に、前駆細胞や幹細胞におけるよりオープンなクロマチン状態から、分化した細胞におけるよりコンパクトなクロマチン状態への緩やかな変化が含まれます。

Science誌に発表された論文において、イスラエルの研究チームは発達中の血球細胞におけるクロマチン状態について調べました。彼らは、すべての主要な血球細胞系統の異なる発達段階において、4つのヒストン修飾(H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3, H3K27ac)を調べることにより、造血の分化段階を特徴づけました。

彼らはiChiP法を用いて48,415個のエンハンサーを同定し、その90％が造血中に変化していることを見出しました。これらのエンハンサーの60％は緩やかに不活性化され、関連する系統でのみ活性を維持するという典型的な挙動を示したのに対し、約40％は分化中に新たに活性化されました。

これらの新規に活性化されたエンハンサーはクロマチンアクセシビリティーの増加に関連するH3K4me1の修飾を含みます。クロマチンがこれらのエンハンサー領域において、よりアクセシブルかどうかを測定するため、H3K4me1およびH3K27acのChIP-SeqデータをATAC-Seqと関連付けて解析を行いました。研究者らは、H3K27acよりもH3K4me1がATAC-Seqのピークとオーバーラップし、密接に相関することを見出しました。このことは、エンハンサー領域におけるH3K4me1の獲得や喪失がアクセシブルなクロマチン構造の形成に影響を及ぼすことを示しています。さらに、ATAC-Seqは造血過程における細胞系譜明確化を調節する新たな因子の発見を可能にしました。

要約すると、著者らはATAC-Seqにより、血球分化中のクロマチン状態はとてもダイナミックであり、エンハンサーは以前に報告されていたように不活性化されるだけでなく、新たに活性化されることを明確に示しました。これは血球細胞の分化と発達におけるクロマチンの大規模な動的再編成の新しいモデルにつながります。

シングルセルATAC-Seq (scATAC-Seq)

数百万もの細胞集団を用いた方法の主な制約は、データの示す結果が常に、集団に属する個々の細胞において起こる現象の平均からなるデータであることであり、サンプル中に存在するであろう細胞ごとのばらつきを平均化して除外し、亜集団における興味深い現象を観察する機会を失ってしまうことです。このばらつきは、発生過程や腫瘍の不均質性(heterogeneity)などでしばしば問題となる、重要な生物学的特徴です。ATAC-Seq法の最初の発明者であるJason Buenrostroと同僚は、ATAC-Seqの改善を試み、ATAC-Seqのプロトコールをシングルセル解析と互換性を持つよう適応させて、Nature誌に発表しました。

彼らの初期の実験は、シングルセル解析を行うためにFluidigm社のマイクロ流体力学プラットフォームを使用しましたが、今日、多くのシングルセルATAC-Seq (scATAC-Seq)のプロトコールは10X Genomics社のプラットフォームを用いています。単一細胞が単離されると、それらはTn5でタグメンテーションされ、ライブラリーは細胞同定用バーコート化プライマーを用いてPCRにより増幅されます。それらのライブラリーはプールされた後、通常通りシーケンスされます。

要約すると、このアプローチによりATAC-Seqは改善され、研究者が多くのサンプル種における生物学的ばらつきを単一細胞レベルで研究できるようになりました。このことは細胞の不均質性の分子基盤をより深く理解することにつながるでしょう。

研究でATAC-Seqを使い始める方法

アクティブ・モティフではend-to-end ATAC-Seq受託サービスを提供しておりますのでATAC-Seqを始める際は私たちにご相談ください。サンプル（細胞や組織）をお送りいただければ数週間後には解析データを手にできます。ATAC-Seq受託サービスは、細胞膜の透過処理、シーケンスアダプターを含むトランスポゼースの添加、トランスポゼースを介したアクセシブルなゲノム領域へのアダプターの挿入、ライブラリー増幅、Illuminaプラットフォームを用いた次世代シーケンサーによるシーケンシングおよび、バイオインフォマティクス解析といった一連の作業を代行します。弊社は、お客様に最高品質のデータを提供することを保証するため、標準的なATAC-Seqのプロトコールを最適化しています。

弊社の受託サービスでは、培養細胞株、初代培養細胞、凍結組織サンプルを受け入れており、細胞の場合は100,000個、凍結組織では20～50 mgの提供をお願いしています。重複アッセイの数(replicate)は常に議論の余地がありますが、弊社のATAC-Seq受託サービスは再現性に優れているため、通常は2個の複製を推奨しています。しかしながら、お客様の実験系において最善のデザインとなるようお客様自身により決定することが可能です。

バイオインフォマティクスデータ解析は弊社専属のエキスパートチームにより行われます。標準的な解析として下記の内容が含まれます：

• シーケンス解析：シーケンスされたリードをリファレンスゲノム上にマッピングし、重複リードを除去します。
• ピーク検出：ペアエンドシーケンスにより得られる両側のリードはピークコールソフトウェアMACS 2.1.0により検出されます。
• フラグメント密度の決定：トランスポゼース反応の密度を決定するため、リファレンスゲノムにマッピングされたリードは、ゲノム全体を32 bp毎に細分化した小区間に割り当てられます。解析するフラグメントの平均サイズが約200 bpであるため、実際にマッピングされた1つのリードが占有する区間は約200 bpに拡張して表されます。
• 正規化：ゲノムにマッピングされた全サンプルのリード数は、ランダムに抽出した領域における、最も少ないリード数との比として正規化されます。
• アクティブ領域解析：２つ以上のサンプル間を比較する場合、比較対象のうち1サンプルでも特定の遺伝子座に複数のピークが検出されたとき、これをアクティブ領域と設定します。これは、比較対象の全サンプル間で検出された最上流のピーク座標から最下流の座標までの区間で定義される独自の指標です。

もし、異種細胞が混合した組織など複雑なサンプルの場合、弊社のシングルセルATAC-Seq受託サービスをご利用いただけます。

ATAC-Seqは以前の方法よりもはるかに高速で簡単ですが、実際に経験したことのない多くの研究者にとっては依然として敷居が高いため、アクティブ・モティフのサービスを利用して信頼性の高いデータを得る研究者が増えています。

まとめ：ATAC-Seq法は、研究者がはじめてエピジェネティクス解析をするときの強力な手法になってきました

エピジェネティクス研究を始めるとき、世の中にある膨大な種類の方法に圧倒されるかもしれません。生物学的な疑問に答えるためのアプローチを1つ選ぶことは、それほど明白でも簡単でもありません。DNase-Seq、FAIRE-Seq、DamID、Hi-CあるいはChIP-Seqのような手法は数百万個の細胞を必要とし、多くの場合、かなりの最適化を必要とします。しかし、最終的には限られた情報しか得られず、サンプル中の不完全なエピゲノムの描像を残すのみです。

ATAC-Seqは、科学者がエピジェネティクス研究を始める方法を変えました。ATAC-Seqは出発材料として約50,000個の細胞のみを必要とする、比較的簡単な二段階プロトコールによりエピジェネティックな旅を開始する魅力的な方法です。

サンプル中のクロマチン状態を解析する場合でも、何か処理をした前後でクロマチン状態を比較する場合でも、ATAC-Seqを使えばゲノム全体のクロマチンの変化を調べることができます。そして、次の実験でどのエピジェネティックな修飾や転写因子を研究すべきか、またそれらの実験をするときにどの方法を用いるべきかの指針を得ることができます。

ATAC-Seqは、エピジェネティクスの世界への第一歩を踏み出し、クロマチンの全体像を研究することをこれまで以上に容易かつ迅速にしました。

もし、ATAC-Seqについて詳しく知りたい、受託サービスの内容を知りたい、見積もりが欲しいなどのご要望がありましたらこちらからお問い合わせください。

About the author

Stefan Dillinger, Ph.D.

Stefan was born in the Free State of Bavaria, Germany. After studying biochemistry in Ulm and Regensburg, he got his Ph.D. in the field of epigenetics, studying the distribution of heterochromatin around nucleoli during cellular senescence. As a graduate student he started his own German science podcast “The Random Scientist” and is now the host of Active Motif’s Epigenetics Podcast. When Stefan is not working at Active Motif or recording podcasts, he is a passionate runner (he finished the New York City Marathon in 3 hours 21 minutes!!) and loves to spend time with his wife and son.

Contact Stefan on LinkedIn with any questions, or to get running advice.

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