バイサルファイト変換

Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS)

RRBSは、制限酵素とDNAサイズセレクションを併用することにより、シーケンシングが必要なゲノム領域の割合を大幅に削減する手法です。まず、メチル化非感受性の制限酵素(一般的にはMspI)を用いてDNAを消化することにより、末端にCpGジヌクレオチドを含む断片を得ます。次に、断片にアダプターをライゲーションしてサイズ選別を行うことにより、DNA中のCpGが豊富な領域を捕捉します。その後、濃縮された断片にバイサルファイト変換と増幅を行い、シーケンシングしてメチル化シトシンを同定します。ヒトサンプルのRRBSは、全ゲノムのわずか3%をシーケンシングするだけで、CpGアイランドの80～85%、プロモーターの50～60%を捉えます。

アクティブ・モティフのRRBS受託サービスは、1サンプルあたり～5,000万リードのシーケンス深度で、最大500万個のCpGに対する1塩基解像度のメチル化データを提供します。このサービスはend-to-endのアッセイとして提供しており、DNA精製から消化、バイサルファイト変換、ライブラリ調製、DNAシーケンス、およびバイオインフォマティクス解析が含まれます。

利点：WGBSよりも低コストで、ゲノム全体にわたるCpGメチル化が豊富な領域を単一塩基解像度でシーケンスできる。
欠点：制限酵素に偏りがある。CpGが豊富な領域以外をカバーできない。ゲノム内のCpGの85～90％を検出できない。
最適な用途：がんなどの疾患において異常なメチル化が共通して見られるプロモーターなどのCpG豊富な領域における変化を探索するのに優れた手法である。

Targeted Bisulfite Sequencing

Targeted Bisulfite Sequencingは、関心のある特定の領域について1塩基解像度で、メチル化を極めて正確に解析することを可能にします。まず、DNAをバイサルファイト処理し、その後プライマーを用いて標的領域を増幅します。こうして得られたアンプリコンは、ライブラリ作製を経てシーケンシングされます。シーケンシングを少数のアンプリコンに限定することにより、対象領域に含まれるシトシンについて、低コストで高いシーケンシングカバレッジを実現します。

利点：関心領域について、低コストで高いシーケンス深度が得られる。
欠点：各領域ごとにプライマーを設計する必要がある。
最適な用途：次項のMSPと同様、関心のある領域が少数の場合に適している。

メチル化特異的PCR (MSP: Methylation-Specific PCR)

MSPは、バイサルファイト処理後に標的領域のメチル化を調べるために用いられます。この手法では、メチル化されたDNAに相補的なプライマーセットと、メチル化されていないDNAに相補的なプライマーセットという、2種類の異なるメチル化状態特異的なプライマーセットを使用します。PCRにより標的DNAを増幅し、その増幅産物をゲル上で電気泳動することにより、どちらのプライマーセットがより多くの増幅産物を生成したかを確認します(エンドポイント解析)。あるいは、TaqMan®プローブ法を用いることもできます。この方法では、メチル化特異的な蛍光プローブをDNAに結合させ、非メチル化特異的なPCRプライマーを用いてその領域を増幅させます。増幅に伴い、結合したプローブはTaqポリメラーゼによって分解されるため、プローブから発せられる光が増加します。メチル化特異的または非メチル化特異的プローブのいずれかのシグナルが増加すれば、それがDNAのメチル化状態を示していることになります(リアルタイム解析可)。

利点：低コストですぐに実行可能。
欠点：最低でも5個のTを含む必要があるため、プライマー設計が困難な場合がある。
最適な用途：関心のある領域が少数の場合のメチル化の評価に最適。

Whole Genome Bisulfite Sequencing (WGBS: 全ゲノムバイサルファイトシーケンシング)

DNAメチル化解析のゴールドスタンダードと呼ばれるWGBSは、あらゆるDNAメチル化解析手法の中で最も高いカバレッジと解析精度を誇ります。まずゲノムDNAを単離し、バイサルファイト変換を行います。その後、DNAにアダプターをライゲーションしてシーケンスライブラリを調製します。シーケンス終了後、バイオインフォマティクス解析を行い、ゲノムワイドなメチル化シトシンを同定します。このような包括的なカバレッジの欠点は、シーケンスコストが高く、解析が複雑になることです。

利点：ゲノム全体にわたるDNAメチル化を単一ヌクレオチドの精度で解析できる。
欠点：シーケンシング解析に費用と時間がかかる。ハイスループットには不向き。
最適な用途：CpG密度の低い領域や遺伝子間の「遺伝子砂漠」、あるいはRRBSでは検出できない部分的なメチル化領域やエンハンサーなどの遠位調節領域の解析に最適である。

メチル化アレイ

メチル化アレイは、チップ上にあらかじめ配置された多数のDNAプローブを用いて、ゲノム中の特定のCpG領域におけるシトシン塩基のメチル化状態を、複数検体同時に定量する技術です。DNAはまずバイサルファイト処理およびPCR増幅を行い、メチル化状態を反映した配列に変換します。その後、特定のメチル化部位を標的とするDNAプローブとハイブリダイズさせます。アレイにはプローブを2種類使用する方法と1種類のものがあります。前者は、各メチル化部位に対して2種類のプローブを用い、その一方はメチル化された配列(Cのまま残った配列)に相補的、もう一方は非メチル化シトシンがバイサルファイト処理によりTに変換された配列に相補的となるよう設計されています。後者では、各CpG部位に対して1本のプローブのみを用い、このプローブをメチル化状態が変化する塩基(バイサルファイト処理によりCまたはTとなる位置)の直前までハイブリダイズさせます。その後、DNAポリメラーゼによりプローブの末端から1塩基だけ伸長させ、その際に取り込まれる塩基の種類(メチル化状態ではCに相補的なG、非メチル化状態ではTに相補的なA)を蛍光標識により識別することで、各部位のメチル化状態を判定します。

利点：使いやすく、再現性が高い。FFPEサンプルにも対応。
欠点：市販のアレイはヒトまたはマウスのDNAにのみ対応。このアッセイには多数のメチル化部位が含まれており、ヒト用ではCpGアイランドの大部分(96%以上)を網羅するが、CpGサイトは2%未満しかカバーされない。
最適な用途：CpGアイランドにおけるメチル化異常の有無に絞った、臨床検体などのスクリーニングに最適。