YourSeq (FT & 3’DGE) Strand-Specific mRNA Library Prep

迅速、柔軟、簡単なRNA-Seq kit

 

YourSeq (FT & 3’DGE) Strand-Specific mRNA Library Prep の概要

RNA-Seq Services

YourSeq (FT & 3’DGE) Strand-Specific mRNA Library Prep kitは、従来のFull Transcript (FT) や3’-Digital Gene Expression (DGE) シーケンス用のライブラリー調製キットよりも、迅速かつ簡単に次世代シーケンス用のライブラリーが調製可能です。

従来からある全長転写産物 (full transcript: FT) RNA-Seqは、転写産物全体 (transcriptome) にマッピングされるシーケンスリードを得ることができます。一方、3’ Digital Gene Expression (3’-DGE) は、転写産物の3’末端側にのみにマッピングされるリードを得ます。3’-DGEでは複数のバリアントも1つの転写産物としてマッピングするため、1/3から1/4程度少ないリード数で解析でき、コストを大幅に削減することが可能です。

YourSeq Library Prepは、DNA breathingという自然現象を利用することで、従来のRNAライブラリー調製プロトコルで必要だったいくつかのステップを省略し、所要時間とコストを大きく改善しています。 DNA breathingとは、熱ゆらぎによってDNAが開閉する現象です。YourSeq Library Prepでは、ファーストストランドcDNA合成に続いて、「Breath Capture」と呼ばれるプロセスにおいて、DNA:RNAハイブリッド分子の末端が開いているcDNAに5’アダプターを挿入します。 これにより、RNAの除去を必要とせずに、酵素的にセカンドストランドDNAの合成が可能となります。アダプターはcDNA鎖をプライミングして付加され、RNA鎖をプライミングできないため、このワークフローにより遺伝子の方向性を維持したストランド特異的RNA-Seq解析が可能となります。

YourSeq (FT & 3’DGE) Strand-Specific mRNA Library Prep Kitは、combinatorial dual indexとunique dual index の2つキットを選択できます。Combinatorial dual indexing (CDI) kitでは、96通りまたは384通りのインデックスの組み合わせが可能です。Unique dual indexing (UDI) kitでは、24または96個のユニークインデックスを使用したマルチプレックスが可能です。このため、HiSeqなどの機器で起こりうるインデックスホッピング (index hopping)、すなわち複数のライブラリー間に誤ったインデックスが割り当てられることを回避することができます。

YourSeq (FT & 3’DGE) Strand-Specific mRNA Library workflow(Click image to enlarge)

YourSeq (FT & 3’DGE) Strand-Specific mRNA Library Prep の特長

  • RNAからのライブラリー調製がわずか4時間
  • Full-transcript (FT) と3’-Digital Gene Expression (DGE) RNA-Seqに対応
  • 高いストランド特異性
  • Combinatorial Dual Indexing (CDI) とUnique Dual Indexing (UDI) を選択可能

FTと3’DGEの比較

YourSeq (FT & 3’DGE) Strand-Specific mRNA Library Prep kitは、2種類のRNA-seqライブラリーを調製するために必要な試薬が含まれています。どちらの方法にも一長一短がありますので、研究のニーズにあった方法を選択してください。

Full Transcript (FT) RNA-Seq

Full Transcript (FT) RNA-Seqは、従来の全転写産物のRNA-Seqで、最も一般的なタイプです。FT RNA-Seqは、発現する全転写産物をマッピングするためのシーケンスリードを生成します。これは、cDNA合成ステップにおけるランダムなRNA断片化とそれに続くランダムなプライミングの組み合わせによって実現されます。その結果、参照トランスクリプトームまたはゲノム配列にマッピングされたときに、発現する全転写産物のエクソン全域に対応するシーケンスリードが得られます。 FT RNA-Seqにおいて遺伝子にマッピングされるリード数は、転写産物の量と長さの関数となります。したがって、長い遺伝子は、転写産物量が同程度の短い遺伝子よりも、マッピングされるリードが多くなります。

FT RNA-Seqでは、サンプルごとに2,000万-3,000万のペアエンドリードが必要ですが、3’-DGE RNA-Seqでは300万-1,000万のシングルリードで済みます。ただし、 FT RNA-Seqが必要な場合もあります。例えば、スプライスバリアント解析やエクソン多型の検出には、翻訳領域全体からのリードが必要です。

Full Transcript (FT) Sequencing

Full Transcript (FT) RNA-Seqが適している解析

  • 遺伝子発現量の違い
  • ジェノタイピングおよびエクソン多型の検出
  • スプライスバリアント解析
  • 融合遺伝子量の検出

3’ Digital Gene Expression (3‘-DGE) RNA-Seq

3’ Digital Gene Expression (3‘-DGE) は、遺伝子発現量の違いを解析するために最適化されています。主な目的は、実験条件に応じてアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされる遺伝子とそれらの経路を特定することです。

3’-DGE RNA-SeqライブラリーのcDNA合成ステップでは、ランダムプライマーを使用せず、オリゴ (dT) 付きアダプターを使用して、転写産物 (mRNA) のポリAテールをプライミングします。そのため、3‘-DGEのリードは、転写産物の3’末端にマッピングされる傾向があります (下図)。転写産物とcDNA分子の間には理論上の1対1の相関関係があるため、転写産物の長さは無関係であり、遺伝子にマッピングされるリードの数は、転写産物の存在量と比例します。したがって、発現レベルが同程度であれば、マッピングされるリードは短い遺伝子と長い遺伝子のいずれも同程度になります。

3’-DGEに伴う複雑さの低減は、最大の利点の1つです。スプライスバリアントを1個の転写産物のリードとしてマッピングするため、バリアントの違いは無視されますが、従来のRNA-Seqより少ないシーケンス深度で確度の高い解析ができます。また、3’-DGEでは、ペアエンドシーケンスは必要ありません。 したがって、従来のRNA-seqライブラリーをサンプルあたり2,000万-3,000万のペアエンドリードでシーケンスしていた場合、3’-DGEライブラリーとすることにより、同じサンプルを300万-1,000万のシングルリードでシーケンスすることができるため、コストの削減もできます。

3’ Digital Gene Expression (3’DGE) Sequencing

3’DGE RNA-Seqが適している解析

  • アノテーションが充実しているゲノムセットを用いる場合、または発現遺伝子とその3’-UTRを調べてアノテーションを改善したい場合
  • 3’-UTRのジェノタイピングおよび多型の検出
  • ポリA近傍配列の差異検出と同定
 

YourSeq (FT & 3’DGE) Strand-Specific mRNA Library Prep の構成品

全ての構成品は、最初に使用するまで-20℃で保管してください。Carboxyl Beadsは、一度融解した後には、4℃で保存してください。

Catalog no. 23001 23002 23003 23004
Indexing CDI CDI UDI UDI
Reactions 24 96 24 96
Reagent  
FT Priming Mix 75 μl 300 μl 75 μl 300 μl
DGE Priming Mix 75 μl 300 μl 75 μl 300 μl
Control mRNA 5 μl 5 μl 5 μl 5 μl
First Strand Mix 135 μl 540 μl 135 μl 540 μl
RT enzyme 15 μl 60 μl 15 μl 60 μl
Breath Capture Mix 175 μl 690 μl 175 μl 690 μl
5-Prime Adapter 120 μl 480 μl 120 μl 480 μl
DNA Pol I 10 μl 30 μl 10 μl 30 μl
PCR Mix 264 μl 1056 μl 264 μl 1056 μl
Phusion Pol 8 μl 24 μl 8 μl 24 μl
Nuclease-Free Water 1.8 ml 1.8 ml 1.8 ml 1.8 ml
10 mM Tris HCl 1.8 ml 5 ml 1.8 ml 5 ml
Carboxyl Beads Buffer 1.8 ml 6 ml 1.8 ml 6 ml
Carboxyl Beads 1.5 ml 6 ml 1.5 ml 6 ml
YourSeq Index i5-A 30 μl 120 μl    
YourSeq Index i5-B 30 μl 120 μl    
YourSeq Index i5-C 30 μl 120 μl    
YourSeq Index i5-D 30 μl 120 μl    
YourSeq i7 1-24 Index Set 1 plate   1 plate  
YourSeq i5 1-24 Index Set     1 plate  
YourSeq i7 1-96 Index Set   1 plate   1 plate
YourSeq i5 1-96 Index Set       1 plate



 

YourSeq (FT & 3’DGE) Strand-Specific mRNA Library Prep のFAQ

YourSeq RNA-Seqの特長は?

YourSeq Library Prepでは、DNA breathingという自然現象を利用することで、従来のRNAライブラリー調製プロトコルでは必要だった時間とコストを大きく改善することができるようになりました。 DNA breathingとは、熱ゆらぎによってDNAが開閉する現象です。 YourSeq Library Prepでは、ファーストストランドcDNA合成に続いて、「Breath Capture」 と呼ばれるプロセスにおいて、DNA:RNAハイブリッド分子の末端が開いているcDNAに5'アダプターを挿入します。 これにより、RNAの除去というステップを必要とせずに、DNAのセカンドストランドの合成が開始可能となります。アダプターはcDNA鎖のみをプライミングし、RNA鎖側をプライミングできないため、このワークフローにより方向性を維持したストランド特異性の高いRNA-Seq解析が可能となります。

Combinatorial Dual Indexing (CDI)とUnique Dual Indexing (UDI)は、どのように選べば良いですか?

Combinatorial Dual Indexing (CDI) では、サンプルごとにインデックス1 (i7) とインデックス2 (i5) とを組み合わせて使用します。そのため、場合によっては一方のインデックスシーケンスを共有する場合があります。 Unique Dual Indexing (UDI) では、サンプルごとにインデックス1 (i7) とインデックス2 (i5) の異なったインデックスの組み合わせで使用します。この場合、インデックスは2回以上使用されません。UDIを使用することで、HiSeq、NovaSeq、iSeqなどのPatterned Flow Cellを採用しているイルミナシーケンサーで稀に起こる、インデックスホッピング (インデックスが誤って割り当てられること) の発生を回避することができます。

RNA ストランド特異性 (Strand Specific) とは?

mRNA転写産物は、gDNAテンプレートのプラス鎖またはマイナス鎖のいずれかから得られます。 ストランド特異的RNAライブラリー調製法では、転写物の元の方向を決定できますが、ストランド特異性がないライブラリー調製法を用いると、この情報が失われ、シーケンスリードがgDNAテンプレートのプラス鎖からのものかマイナス鎖からのものかを判断できなくなります。

どのようにしてストランドの選択性を持たせていますか?

ストランド特異性のないRNAライブラリー調製キットでは、転写されたRNAがまず断片化されて、ランダムプライマーによってファーストストランド (1本目) とその相補鎖 (セカンドストランド) のcDNAが合成された後、アダプターの付加と断片の増幅が行われます。その結果、2つの相補的な転写産物のファーストストランドとセカンドストランドのcDNA鎖は全く同じように見え、シーケンスされたときに区別できません。一方、 YourSeqワークフローでは、cDNAのファーストストランドにのみ5'アダプターを付加することが可能です。転写産物がcDNA-RNAハイブリッドの状態である間にcDNA鎖をプライミングし、RNA鎖をプライミングできないDNA依存性DNAポリメラーゼ (DNA Pol I) を使用することで、遺伝子の方向性を維持したcDNAを合成できます。

3’DGEとは何ですか?

3'-DGE RNA-seqライブラリーの場合、cDNA合成ステップでは、オリゴ (dT) を備えたアダプターを使用して、転写産物のポリAテールをプライミングします。 これは、3'-DGEリードが、転写産物の3'末端にのみマッピングされる傾向があることを意味します。転写産物分子とcDNA分子の間には理論上の1対1の相関関係があるため、転写産物の長さは無関係であり、遺伝子にマッピングされるリードの数は、転写産物の存在量の関数にすぎません。 したがって、長い遺伝子は、転写産物量が同程度の短い遺伝子と同じ数のリードマッピングを持ちます。

3'DGE RNA-Seqを利用する利点は?

3’-DGEに関連する最大の利点の1つは、解析の複雑さを少なくすることです。 トランスクリプトカウント (転写産物の数を数えること) により、従来のRNA-seqと比較して、確度の高い解析に必要なシーケンス深度を浅くすることができます。また、3’-DGEでは、ペアエンドシーケンスは必要ありません。 したがって、従来のRNA-seqライブラリーをサンプルあたり2,000万-3,000万のペアエンドリードでシーケンスしていた場合、同じサンプルを3’-DGEライブラリーとすることにより、300万-1,000万のシングルリードでシーケンスすることができるため、コストを削減することもできます。

3'DGE RNA-Seqでは難しいことは?

3'DGE RNA-Seqでは転写産物の3'末端のみをカバーするため、エクソン多型の検出、スプライスバリアント解析、または遺伝子融合量の検出には適していません。 この種の情報は、転写産物全体をシーケンス (Full Transcript RNA-Seq) することによってのみ決定できます。

Full Transcript RNA-Seqで解析する理由は?

全転写産物からの解析が必要な場合には、Full Transcript RNA-Seqが必要です。例えば、エクソン多型の検出、スプライスバリアント解析、または遺伝子融合量の検出に使用する際は、Full Transcirpt RNA-Seqの実施が求められます。

Full Transcript RNA-Seqでは難しいことは?

Full Transcript RNA-seqの唯一の欠点は、ライブラリーの複雑さが増すため、サンプルごとに少なくとも2,000万-3,000万のペアエンドリードが必要になるため、コストが高くなることです。

どのようなRNAを使えばいいですか?

YourSeq (FT&3'DGE) Strand-Specific mRNA Library Prep Kitは、ポリAが濃縮されたmRNAまたはリボソームRNAを除いたmRNAのいずれかで使用できます。

rRNA depletionとmRNA selectionの違いとは?

リボソームRNA (rRNA) 除去法は、トータルRNAの精製ステップまたは精製後に、rRNAを除去し、最終的にmRNAを濃縮する方法です。ライブラリーの調製中にも実行できます。一方、ポリA濃縮法では、オリゴdTプライマーを使用して、mRNA転写産物のポリアデニル化された3'末端を選択的に捕捉し、最終的にmRNAが濃縮されるようにします。

シーケンスのリード数はどれくらいが良いですか?

Full transcript (FT) RNA-seqライブラリーの場合、サンプルあたり2,000万-3,000万のペアエンドリードをお勧めします。 3’-DGEライブラリーの場合、サンプルあたり300万-1,000万のシングルリードをお勧めします。

キットにコントロールは含まれていますか?

はい、キットには、キイロショウジョウバエ (Drosophila melanogaster) のmRNAがポジティブコントロールとして入っています。


 

YourSeq (FT & 3’DGE) Strand-Specific mRNA Library Prep の資料

 

 

 

YourSeq (FT & 3’DGE) Strand-Specific mRNA Library Prep の購入

 



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