RRBS (Reduced Representation Bisulfite Sequencing)

single base pair resolution DNA methylation analysis

Reduced Representation Bisulfite Sequencing(RRBS)は、最大500万個のCpG領域において1塩基対の分解能でDNAメチル化データを取得でき、サンプル間でのメチル化の差も容易に同定することが可能です。 Whole Genome Bisulfite Sequencingよりも費用効果が高く、ビーズアレイベースのDNAメチル化プラットフォームよりも広い範囲のデータを取得できるため、RRBSはサンプル間でDNAメチル化をプロファイリングする理想的なプラットフォームです。

RRBS の特長:

  • サンプルあたり、最大500万CpGのメチル化データを取得
  • プロモーターおよびCpGアイランドを含む生物学的に関連性のある標的領域の情報
  • シークエンスの深さは、シングルエンド30,000,000 リード以上
  • DNAの必要量はわずか 100 ng
  • ランダムなバーコードの組み込みによりPCR重複を除去し、ライブラリの偏りを軽減

RRBSについての詳細はこちら

Deliverables:

  • Raw data (FASTQ) output files
  • Aligned data (BAM) files
  • Methylation table includes percent methylation value for each CpG
  • Differential methylation analysis
  • Figures & graphs
    – Includes coverage depth analysis, correlation plots, and pie charts
RRBS Overview flow chart

詳細にお知りになりたい場合、テクニカルな問い合わせ等は、 Epigenetic Services Information Request.からご連絡ください。受託サービスの総合カタログはこちら>> Epigenetic Services Profile.

What our customers are saying about us...

"We worked with Active Motif to process some FFPE and frozen liver samples sourced from 25+year old samples for an RRBS assay. The overall process of submitting samples, communicating with Active Motif, receiving the data, and obtaining the summary was quick and painless. The whole operation was smooth and professionally done."

Brian Chorley, PhD
Environmental Protection Agency
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RRBS 25069 Get Quote

RRBS Background & Data

RRBSは、DNAエンドヌクレアーゼ消化と、300bpより小さいDNA断片の増幅により、CpGを含むDNAを単離しメチル化の程度を解析する方法である。 簡単に述べると、まずメチル化非感受性エンドヌクレアーゼMsp1およびTaq1を用いて、それぞれC ^ CGGおよびT ^ CGGを切断し、CpGを有するDNA断片を生成します。 CpGアイランドおよびプロモーターは高密度のCpGを有するので高い頻度で切断され、これらの領域由来の断片は短くなる傾向になります。 短いフラグメントのサブセットは、PCRを使ったライブラリー作成の際に優先的に増幅され、シーケンシングクラスター生成中に追加の選択が行われます。DNAフラクションはシーケンスされ、トータルゲノムの中の小さい断片ではあるが、CpGに富んでいる配列が取得できます。これらの断片は、ゲノムにマッピングされ、数百万あるCpGのメチル化状態を明らかにすることが可能となります。

RRBS data from human samples
Figure 1: RRBS data from human samples.

The displayed regions are representative regions from the genome-wide data set and shows differential DNA methylation at 1A) an exon of CD19 and 1B) an intron of PAX5. Each block is a separate data point with red representing a methylated cytosine and blue representing an unmethylated base.


RRBS data illustrating sequencing depth coverage for any given CpG
Figure 2: Graph illustrating sequencing depth coverage for any given CpG.

The minimum sequence depth for a CpG to be included in the analysis is 10. Over 1 million CpG sites have a coverage of at least 10 reads.


RRBS data illustrating the correlation between each sample analyzed
Figure 3: Graph illustrating the correlation between each sample analyzed.

The upper right corner shows the Pearson correlation coefficient for the two samples. The bar plots show the distribution of the percent methylation in each sample, with the majority of analyzed CpG sites having 0 or 100% methylation. The scatter plot in the lower left corner shows the level of methylation at shared CpG sites for each sample.


RRBS data showing the assignment of differentially methylated cytosines to genic features
Figure 4: Pie chart showing the assignment of differentially methylated cytosines to genic features.

A differential methylation analysis was performed on a per CpG basis, and identified sites were then aligned to annotated gene features such as promoters and exons.