ChIP-IT High Sensitivity®

転写因子抗体や幹細胞試料を用いたChIP解析が可能

 

ChIP-IT High Sensitivity® の概要

The ChIP-IT High Sensitivity®Kitは入手可能な製品としては最も高感度なChIPキットの一つです。本キットは、豊富な標的タンパク質の場合、1回のChIP反応あたり最少1,000個の細胞から高品質なDNAを濃縮できるように設計されています。また、転写因子などの存在量の少ないタンパク質に対する抗体や、標的に対し結合の弱い抗体を用いた免疫沈降においても優れた結果を得られるよう最適化されています。弊社が提供する各種ChIPキットの特徴や使い分けについてはChIPキット選択ガイドをご覧ください。

特製のプロテインGアガロースビーズおよび最適化されたfixation、bindingおよびwash bufferにより高いシグナルと、非特異的DNAのプルダウンを低減することが可能です。さらに、洗浄はフィルター濾過により行いますが、これは迅速かつ簡便で磁気ビーズによる吸着よりも再現性の高い結果が得られます。ChIP-IT High Sensitivity®キットは、存在量の少ない転写因子を標的とした抗体を用いたときにもChIP-Seqが行えることが検証されています。

ChIP-IT HS
ChIP-IT High Sensitivity (HS) Kit (click to enlarge)

ChIP-IT High Sensitivity® の優位性

  • 存在量の少ない転写因子や力価の低い抗体の使用に対応
  • 存在量の多いタンパク質を標的とする場合、1回の免疫沈降に1,000細胞から、相対的に存在量の少ない転写因子でも50,000細胞から対応
  • 最適化された試薬により非特異的な結合を抑え、バックグラウンドを低減
  • フィルターベースの洗浄作業により、磁気吸着よりも優れた再現性
  • 様々なサンプルを用いて検証されたqPCRとChIP-Seqにおける優れたパフォーマンス

How does the ChIP-IT High Sensitivity® Kitの概要

Diagram demonstrating the method of the ChIP-IT High Sensitivity Kit from Active Motif
図1: ChIP-IT High Sensitivityを用いた免疫沈降の概略図

ChIP-IT High Sensitivity®では、まずタンパク質/DNA相互作用を架橋・保持するために配合されたホルムアルデヒド緩衝液で無傷な細胞を固定します。次に、ソニケーターを用いてDNAを小さく断片化します。さらに、目的のDNA結合タンパク質に対する抗体とインキュベートし、その後、プロテインGアガロースビーズを用いて、抗体の結合したタンパク質/DNA複合体を免疫沈降し、さらにフィルター濾過によりビーズを洗浄します。免疫沈降後のDNAを脱架橋し、タンパク質をProteinase Kにより分解除去してDNAを回収・精製します。ChIP濃縮されたDNAは、qPCR、NGS解析のいずれにも利用できます。

ChIP-IT High Sensitivity® Kitと互換性があるキット

  • ChIP-IT® qPCR Analysis Kit – simplifies qPCR data analysis and enables normalization across multiple sample types and experiments
  • High Sensitivity Chromatin Preparation - ChIPにおいて、培養細胞または組織サンプルからホルムアルデヒド固定されたクロマチンを単離するために使用します。
  • qPCR Primer Sets – モデル生物を用いたChIP-qPCR用コントロールプライマーセットを取り揃えております。
  • Antibodies – ChIP-IT High Sensitivity Kit と共に使用して高品質なChIPデータを得ることができる抗体を豊富に用意しています。

さらに、弊社のエピジェネティクス受託サービスではChIP、ChIP-Seqの他、様々なゲノムワイドなデータ生成と解析の受託サービスを行っております。

Become a ChIP Assay Expert
 

ChIP-IT High Sensitivity® の構成品と保存条件

ChIP-IT High Sensitivity KitおよびHigh Sensitivity Chromatin Preparation Kitは、ドライアイスを入れて出荷しますが、キットには様々な保存温度の試薬等が含まれます。製品を受け取ったら各構成品は下記の温度で保存してください。全ての試薬等は、適切に保存された場合、受け取りから6ヶ月間保証します。プロテインGアガロースビーズは、受け取り後に再凍結しないでください。各キットには下記の構成品が含まれます。

High Sensitivity Chromatin Preparation Kitは、ChIP-IT High Sensitivity Kitと合わせてご使用いただく製品であり、フルスケールのChIP反応に進む前に、サンプルの固定、DNAの断片化およびサンプル溶解の各条件を最適化するために必要な試薬のみ含まれます。

ChIP-IT High Sensitivity Kit

  • RNase A (10 µg/µl); Store at -20°C
  • Proteinase K (10 µg/µl); Store at -20°C
  • 100 mM PMSF; Store at -20°C
  • Protease Inhibitor Cocktail (PIC); Store at -20°C
  • Precipitation Buffer; Store at -20°C
  • Carrier; Store at -20°C
  • 10X PBS; Store at -20°C
  • Blocker; Store at -20°C
  • Fixation Buffer; Store at 4°C
  • Protein G Agarose beads; Store at 4°C
  • Stop Solution; Store at RT
  • Chromatin Prep Buffer; Store at RT
  • ChIP Buffer; Store at RT
  • Wash Buffer AM1; Store at RT
  • Elution Buffer AM4; Store at RT
  • ChIP Filtration Columns; Store at RT
  • 5 M NaCl; Store at RT
  • TE, pH 8.0; Store at RT
  • Detergent; Store at RT
  • DNA Purification Binding Buffer; Store at RT
  • 3 M Sodium Acetate; Store at RT
  • DNA Purification Wash Buffer; Store at RT
  • DNA Purification Elution Buffer; Store at RT
  • DNA Purification Columns; Store at RT

High Sensitivity Chromatin Prep Kit

  • RNase A (10 µg/µl); Store at -20°C
  • Proteinase K (10 µg/µl); Store at -20°C
  • 100 mM PMSF; Store at -20°C
  • Protease Inhibitor Cocktail (PIC); Store at -20°C
  • Precipitation Buffer; Store at -20°C
  • Carrier; Store at -20°C
  • 10X PBS; Store at -20°C
  • Fixation Buffer; Store at 4°C
  • Swelling Buffer; Store at 4°C
  • Stop Solution; Store at RT
  • Chromatin Prep Buffer; Store at RT
  • ChIP Buffer; Store at RT
  • DNA Purification Elution Buffer; Store at RT
  • 5 M NaCl; Store at RT
  • TE, pH 8.0; Store at RT
  • Detergent; Store at RT
 

ChIP-IT High Sensitivity® のデータ

存在量の少ない標的タンパク質の検出

ChIP-IT High Sensitivity® (HS)キットは、存在量の少ないタンパク質とDNAの特異的結合を検出するのに十分な感度を備えているため、他のChIP法ではシグナルを得ることが難しい抗体を用いるときに最適です。以下はChIP-IT High Sensitivityと競合他社の入手可能な市販キットとの比較です。未処理のMCF-7細胞のクロマチンと存在量の少ないNCOA2 (nuclear receptor co-activator 2)に結合する抗体を用いてChIPを行いました。また、非特異的結合をモニターするため、同時に抗体のネガティブコントロールとしてIgGおよびnegative control primer set (Active Motif Cat. No. 71001)も用いました。ChIP-IT HSを利用したときのみ特定のゲノム上の位置(ESRRAプロモーター)においてNCOA2の結合が検出され、ネガティブコントロールに比べて約20倍高い濃縮が得られました。競合D社のキットを用いたESRRAのqPCRのシグナルは、ネガティブコントロールプライマーを用いた場合にもバックグランドが高く、IgGコントロールサンプルにおける非特異的な結合でも増幅が見られており、濃縮レベルは乏しい結果となりました。

PCR analysis showing specific enrichment from low abundance target proteins
図2: 存在量の少ない転写因子を標的としたChIPキットの比較

1.5 x 106個のMCF-7細胞から各キットの推奨条件にしたがい、クロマチンをChIPアッセイ用に調製した。ChIPは各社のプロトコールに記載された最適な量のクロマチンと、存在量の少ないNCOA2タンパク質に対する抗体およびネガティブコントロールIgGを用いて実施した。データをノーマライズして直接比較できるようにするため、濃縮の後、ChIP-IT qPCR Analysis Kit (Cat. No. 53029)を用いてqPCRを実施した。データは反応中のクロマチン量、再懸濁容量およびプライマー効率について調整された生データ3回分の平均を示し、1,000細胞あたりに検出される結合イベントとして表した。


より高い感度を実現

高品質な抗H3K4me3抗体(Cat. No. 39915)を用いて、ChIP-IT High Sensitivityと競合M社、競合I社、競合D社のキットを比較したところ、ポジティブコントロールのGAPDHプロモーターに特異的なシグナルを示しました。ChIP-IT High Sensitivityに最適化した条件において、検出可能な濃縮は、競合M社および競合I社よりも2〜3倍高くなりました。競合D社のキットではネガティブコントロールqPCRプライマーやIgGコントロールでも非特異的なシグナルが見られ、良好な濃縮を示しませんでした。

PCR analysis showing specific enrichment from low abundance target proteins
図3: ChIP-IT High Sensitivityは、競合他社製品よりも優れた濃縮を実現

1.5 x 106個のMCF-7細胞から各キットの推奨条件にしたがい、クロマチンをChIPアッセイ用に調製した。 ChIPは各社のプロトコールに記載された最適な量のクロマチンと、存在量の豊富なヒストンH3K4me3に対する抗体(Cat No. 39915)およびネガティブコントロールIgGを用いて実施した。濃縮の後、ChIP-IT qPCR Analysis Kit (Cat. No. 53029)を用いてqPCRを実施した。データは反応中のクロマチン量、再懸濁容量およびプライマー効率について調整された生データ3回分の平均を示し、1,000細胞あたりに検出される結合イベントとして表した。


少量サンプルでの利用

ChIP-IT High Sensitivityに含まれる最適化されたChIPバッファー群が非特異的なDNAの存在を抑制することにより、バックグラウンドレベルを最少に留めます。これにより感度の上昇と優れた濃縮を実現します。このバックグラウンドの低減が、ChIP-IT High Sensitivityキットで用いる免疫沈降1反応あたりの細胞量を1,000個(存在量が豊富なタンパク質)あるいは50,000個(存在量が少ないタンパク質)にすることを可能としました。以下に示す実験では、ヒストンH3K4me3に対する抗体と1,000~1,000,000個の細胞から得たクロマチンを用いてChIPを行いました。

PCR analysis showing successful ChIP using samples from 1,000 cells
図4: ChIP-IT High Sensitivityは量の限られたサンプルにも適合

ChIP-IT High Sensitivityキットのマニュアルにしたがい、各免疫沈降につき105から4 x 106個のMCF-7細胞からクロマチンを調製した。免疫沈降は、図に示した数の細胞に対し、アクティブ・モティフの抗Histone H3K4me3抗体(Cat No. 39915)およびネガティブコントロールIgGを用いて実施した。濃縮の後、ChIP-IT qPCR Analysis Kit (Cat. No. 53029)を用いてqPCRを実施した。ChIP-IT High Sensitivityキットは、わずか1,000個の細胞からポジティブコントロールであるGAPDHプロモーターにおいて顕著な濃縮を示し、ネガティブコントロールであるUntr 12プライマーでは濃縮されないことを示した。データは反応中のクロマチン量、再懸濁容量およびプライマー効率について調整された生データ3回分の平均を示し、1,000細胞あたりに検出される結合イベントとして表した。


濃縮されたDNAはChIP-Seq検証済み

ChIP-IT High Sensitivityキットを用いて得られたChIP DNAは高品質なのでChIP-Seqのような下流アプリケーションにご使用いただけます。アクティブ・モティフは、下に示すようにChIP-IT High SensitivityがChIP-Seqに利用できることを存在量の少ないタンパク質および豊富なヒストンタンパク質に対する抗体両方で検証しています。

ChIP-Seq data for the low abundance target NCOA
図5:存在量の少ない転写コアクティベーターNCOA2に対するChIP-Seqのデータ

ChIP-IT High Sensitivityキットを用いて3 x 106個のMCF-7細胞からクロマチンを調製し、存在量の少ない転写コアクティベーターNCOA2に対する抗体を用いてChIPを実施した。ChIP DNAをIllumina® Next-Gen sequencing platformで処理し、30 Mシーケンスタグを生成した。シーケンスデータは、ヒトゲノムにある全てのNCOA2結合部位を同定することを目的として解析した。左図は、11番染色体中1,000,000 bpに渡る領域における複数の結合部位を示す。図右は、2つの遺伝子プロモーターにおけるNCOA2のピークを拡大した。

ChIP-Seq data using Histone H3K4me3
図6: Histone H3K4me3に対するChIP-Seqのデータ

ChIP-IT High Sensitivityキットを用いて106個のMCF-7細胞からクロマチンを調製し、抗Histone H3K4me3抗体 (Cat. No. 39915) を用いてChIPを実施した。ChIP DNAをIllumina® Next-Gen sequencing platformで処理し、24 Mシーケンスタグを生成した。ヒトゲノムにある全てのH3K4me3の結合部位を同定するためシーケンスデータの解析を実施した。左図は、11番染色体中175,000 bpに渡る領域における5個の遺伝子プロモーターにおけるH3K4md3の結合部位を示す。図右は、単一遺伝子のプロモーターにおけるピークの拡大を示す。PPFA1遺伝子における結合は、H3K4me3で共通して見られるように転写開始部位において欠損した二重ピークとなった。

 

ChIP-IT High Sensitivity® についてのFAQs

クロマチン調製に必要な最少の細胞数は?

ChIP-IT High Sensitivityキットはクロマチンの調製に最低100,000細胞を必要としますが、このクロマチンは複数回のChIP反応用として分注可能です。

一度のIPに使うインプットクロマチンの最少および最大量は?

存在量の多いヒストンマークに対する抗体の利用では、このキットは1度のChIPにつきわずか1,000細胞から得た濃縮クロマチン(6.7 ngのクロマチン)で検出可能です。転写因子の抗体では50,000細胞(330 ng)以上のクロマチンを使用することを推奨します。

上限としては、30 μgを超えないことを推奨します。これは大まかに4.5 x 106個の細胞から得られる量に相当します(大まかに1.5 x 106個の細胞から10 μgが得られると計算)。このキットにおける理想的なクロマチン量の範囲は10-30 μgであり、1.5-4.5 x 106個の細胞量に相当します。

浮遊細胞はどのように固定しますか?

接着細胞と同様、培地の1/10量のComplete Cell Fixative solutionを培養中の細胞に直接添加してください。

プロトコールの途中で作業を止めることはできますか?

このキットのプロトコールでは下記のタイミングと温度で中断することができます。

  1. ホルムアルデヒド固定して遠心した後(無傷の細胞ペレット): -80℃
  2. クロマチンの断片化後:-80℃
  3. DNAの精製後:-20℃

クロマチンはどのように断片化しますか?

ChIP-IT High Sensitivityキットのプロトコールは弊社のEpiShear™プローブソニケーターを使って検証しています。Diagenode社のBioruptorのような他社製品もご利用可能と思われますが、断片化条件も異なることが予想されます。Covaris社のシステムは本キットのバッファーと互換性がないため別のプロトコールが必要となります。Tech Note: Sonication Recommendations for ChIPをご覧いただくか、またはテクニカルサポートまでお問い合わせください。

ChIP-IT High Sensitivity Kitで得られた断片化DNAをバイオアナライザにかけると分子量が大きいように見えますが、ソニケーションが不十分なのでしょうか?

ソニケーションが正しくできていても、ChIP-IT High Sensitivityのバッファーが原因となり、バイオアナライザによる解析において分子量が実際より大きく見える場合があります。このため、クロマチン断片化効率の確認にはアガロースゲルの使用を推奨します。また、キットのマニュアルに記載のとおり、アガロースゲルを用いた可視化の前に、高塩濃度および高温による変性の工程が必須となりますのでご注意ください。

どの抗体が利用可能ですか?

通常の免疫沈降で用いられるSDSは抗体-タンパク質結合を還元してしまうため、ChIP検証済みの抗体を使用することが重要です。ウェスタンブロットのような他の用途に利用できる多くの抗体はChIPには利用できません。弊社のChIP検証済み抗体のリストをご確認ください。もし、検証済みの抗体が見当たらない場合は、PFAなどで固定した材料を用いた免疫蛍光法(IF)や免疫組織化学(IHC)に使用された抗体が掲載された文献を確認することをお奨めします。

細胞の破砕法について改善策はありますか?

  1. ダウンスホモジナイザーで十分に破砕できない場合は、28-30ゲージの注射針を試してください(検索サイトで「インスリン用シリンジ」を検索してください)。4-5回針を通すことで破砕できます。
  2. 固定時間を短縮してください。
  3. 特にPBMC (白血球、単球および樹状細胞)のような破砕が困難な細胞には、低浸透圧のSwelling Bufferを含むHigh Sensitivity Chromatin Preparation Kit (Cat. No. 53046)の併用や、これらの細胞のために最適化されたChIP-IT PBMC Kit (Cat. No. 53042)への切り替えをご検討ください

ChIPアッセイにはどのようなコントロールを使うべきですか?

ポジティブコントロールやネガティブコントロールとして、それぞれ転写因子や修飾ヒストンの存在が知られているまたは存在しないことが知られている特定のゲノム領域に特異的なqPCRプライマーの使用を提案します。

また、ポジティブおよびネガティブコントロール抗体を使用することも可能です。ポジティブコントロール抗体は、標的とする遺伝子座を認識するタンパク質に対するものです。ネガティブコントロール抗体としてはマウスのIgGが共通して使用されます。

ChIP-Seqには、偽陽性のピークを識別するため、あるいは重複したゲノム領域を明らかにするために通常「インプットDNAコントロール」が用いられます。このコントロールは、細胞固定とソニケーション処理は行いますが、免疫沈降を行いません。各ChIP反応に用いるDNA量の1-10%を使用することを提案します。

アクティブ・モティフは、ChIP-IT Control Kits, ChIP-IT qPCR Primer Sets, Ready-to-ChIP Chromatin およびChIP-IT qPCR Analysis KitなどコントロールやChIP実験を検証するための数多くの関連商品も取り扱っています。

ChIP-IT High Sensitivity Kitを初めて使用するので、サンプルの固定やクロマチン断片化、溶解の最適化をする必要があります。免疫沈降に進む前に、キットのクロマチン調製試薬を使用せずに最適化のための予備実験を行う方法はありますか?

クロマチン断片化の最適化をしていただくために、High Sensitivity Chromatin Prep Kit をご用意しています。ChIP-IT High Sensitivity Kitと合わせてお使いいただけるこの製品には、フルスケールのChIP反応を行う前に、サンプルの固定、クロマチンの断片化、および溶解条件を最適化するための試薬類が含まれます。


 

ChIP-IT High Sensitivity® を用いた文献

以下に、一部の使用例を掲載します。


 
 


 

ChIP-IT High Sensitivity® の技術資料

 


 

Order ChIP-IT High Sensitivity®

 



こちらもご参照ください:

 
Name Format Cat No. Price  
ChIP-IT High Sensitivity® 16 rxns 53040 ¥94,400 Buy
High Sensitivity Chromatin Preparation 16 rxns 53046 ¥48,000 Buy
ChIP-IT® Fixation Buffer 3 ml 53038 ¥18,500 Buy
Protein G Agarose Columns 30 rxns 53039 ¥61,000 Buy
5 rxns 53037 ¥14,000 Buy
Protein G Agarose Beads 1.2 ml 37499 ¥27,000 Buy
TE, pH 8.0 35 ml 37515 ¥15,000 Buy
ChIP Buffer 50 ml 37516 ¥15,000 Buy
Blocker 0.1 ml 37498 ¥15,000 Buy

ChIP-IT High Sensitivity® Advantages

  • Ideal for low abundance transcription factors or antibodies with low binding affinities
  • Sensitive enrichment of DNA from as little as 1,000 cells per immunoprecipitation reaction for high abundance target proteins and as little as 50,000 cells for low abundance transcription factors
  • Optimized reagents reduce background levels caused by non-specific binding events
  • Filtration based washes offer a faster, easier solution with better consistency than magnetic capture
  • Highly robust procedure has been validated across multiple sample types with proven performance in both qPCR and ChIP-Seq analysis

How does the ChIP-IT High Sensitivity® Kit work?

Diagram demonstrating the method of the ChIP-IT High Sensitivity Kit from Active Motif
Figure 1: Schematic of chromatin immunoprecipitation using ChIP-IT High Sensitivity.

In ChIP-IT High Sensitivity®, intact cells are fixed with a specially formulated formaldehyde buffer, which cross-links and preserves protein/DNA interactions. DNA is then sheared into small fragments using sonication and incubated with an antibody directed against the DNA-binding protein of interest. The antibody-bound protein/DNA complexes are immunoprecipitated through the use of Protein G agarose beads and washed via gravity filtration. Following immunoprecipitation, the DNA cross-links are reversed, the proteins are removed by Proteinase K and the DNA is recovered and purified. ChIP enriched DNA can be used for either gene-specific or whole-genome analysis.

Detect Low Abundance Protein Targets

The ChIP-IT High Sensitivity® Kit is ideal for use with challenging antibodies that do not give signal with other ChIP methods, as the method is sensitive enough to detect specific binding of even low abundance proteins. Below is a comparison of ChIP-IT High Sensitivity with other commercially available ChIP kits. ChIP was performed using untreated MCF-7 chromatin and an antibody that binds the low abundance nuclear receptor co-activator 2 (NCOA2) transcriptional co-factor. It was also performed with a negative control IgG and a negative control primer set (Active Motif Catalog No. 71001) to monitor non-specific binding. Only the ChIP-IT High Sensitivity method was able to detect NCOA2 binding at specific genomic locations (ESRRA promoter), providing approximately 20-fold higher enrichment than the negative controls. Although ESRRA shows qPCR signals using the kit from Competitor D, the enrichment levels are poor due to the high background from the negative control primer set and the non-specific binding detected with the IgG.

PCR analysis showing specific enrichment from low abundance target proteins
Figure 1: Comparison of ChIP kits targeting a low abundance transcription factor.

MCF-7 chromatin was prepared according to each manufacturer's recommendations for their ChIP assay from 1.5 x 106 cells. ChIP was performed with the optimal amount of chromatin as suggested by the protocol for each manufacturer using an antibody for the low abundance NCOA2 protein and a negative control IgG. Following enrichment, qPCR was performed using the ChIP-IT qPCR Analysis Kit (Catalog No. 53029) in order to normalize the data and allow for direct comparison of the results. Data is expressed as binding events detected per 1,000 cells which represents the average of the raw data triplicates adjusted for the amount of chromatin in the reaction, the resuspension volume and the primer efficiency.


Achieve Greater Sensitivity

A comparison of ChIP-IT High Sensitivity to other commercially available ChIP Kits when using the high-quality H3K4me3 antibody (Catalog No. 39915) shows specific signal for the positive control GAPDH promoter (Catalog No. 71006) using ChIP-IT HS, Competitor M and Competitor I's Kits. Due to the optimized conditions with the ChIP-IT High Sensitivity, the detectable enrichment was 2-3 fold higher than the enrichment obtained from Competitor M and Competitor I. Only Competitor D did not show good enrichments as a result of high non-specific binding as seen with the signal from the negative control qPCR primer set and the high signal in the IgG reactions.

PCR analysis showing specific enrichment from low abundance target proteins
Figure 2: ChIP-IT High Sensitivity shows better enrichment than competitor ChIP Kits.

MCF-7 chromatin was prepared according to each manufacturer's recommendations for their ChIP assay from 1.5 x 106 cells. ChIP was performed with the optimal amount of chromatin as suggested by the protocol for each manufacturer using an antibody for the abundant Histone H3K4me3 (Catalog No. 39915) and a negative control IgG. Following enrichment, qPCR was performed using the ChIP-IT qPCR Analysis Kit (Catalog No. 53029) in order to normalize the data and allow for direct comparison of the results. Data is expressed as binding events detected per 1,000 cells which represents the average of the raw data triplicates adjusted for the amount of chromatin in the reaction, the resuspension volume and the primer efficiency.


Use Less Sample Material

The optimized ChIP buffers included in the ChIP-IT High Sensitivity Kit reduce the presence of non-specific DNA, thereby minimizing background levels. This results in a increased sensitivity and better enrichment. The reduced background makes it possible to use the ChIP-IT High Sensitivity Kit with as little as 1,000 cells per immunoprecipitation reaction for high abundance proteins and as little as 50,000 cells per immunoprecipitation reaction for low abundance proteins. In the experiment below, ChIP was performed using the Histone H3K4me3 antibody and chromatin from 1,000 to 1 million cells. Significant enrichment was still detectable at the positive control GAPDH promoter when using only 1,000 cells.

PCR analysis showing successful ChIP using samples from 1,000 cells
Figure 3: ChIP-IT High Sensitivity is suitable for use with limited sample material.

MCF-7 chromatin was prepared according to the ChIP-IT High Sensitivity manual using between 100,000 to 4 million cells per chromatin preparation. The immunoprecipitation was then performed using the indicated number of cells with Active Motif's Histone H3K4me3 antibody (Catalog No. 39915) and a negative control IgG. Following enrichment, qPCR was performed using the ChIP-IT qPCR Analysis Kit (Catalog No. 53029). The ChIp-IT High Sensitivity Kit shows strong enrichment with the positive control GAPDH promoter from as little as 1,000 cells and no enrichment with the negative control Untr12 primer set. Data is expressed as binding events detected per 1,000 cells which represents the average of the raw data triplicates adjusted for the amount of chromatin in the reaction, the resuspension volume and the primer efficiency.


Enriched DNA is ChIP-Seq Validated

The ChIP DNA obtained from the ChIP-IT High Sensitivity Kit is of high quality and can be used in downstream applications such as ChIP-Seq or ChIP-chip. Active Motif has validated the ChIP-IT High Sensitivity Kit for ChIP-Seq with both challenging antibodies that target low abundance proteins and highly abundant histone proteins as shown below.

ChIP-Seq data for the low abundance target NCOA
Figure 4: ChIP-Seq data for the low abundance transcription factor NCOA2.

ChIP was performed using the ChIP-IT High Sensitivity Kit, an antibody against the low abundance transcriptional co-activator NCOA2 and chromatin from 3 million MCF-7 cells. ChIP DNA was processed and 30 million sequence tags were generated using the Illumina® Next-Gen sequencing platform. The sequence data was analyzed to identify all NCOA2 binding sites in the human genome. The left panel shows multiple binding sites across a 1 million base pair region on chromosome 11. The image in the right panel is zoomed in to show NCOA2 peaks in the promoters of two genes.

ChIP-Seq data using Histone H3K4me3
Figure 5: ChIP-Seq data for Histone H3K4me3.

ChIP was performed using the ChIP-IT High Sensitivity Kit, an antibody against Histone H3K4me3 (Catalog No. 39915) and chromatin from 1 million MCF-7 cells. ChIP data was processed and 24 million sequence tags were generated using the Illumina® Next-Gen sequencing platform. The sequencing data was analyzed to identify all the H3K4me3 binding sites in the human genome. The left panel shows the presence of the H3K4me3 in the promoters of 5 genes across a 175,000 bp region on chromosome 11. The image in the right panel is zoomed in to show binding in the promoter of a single gene. Binding at the PPFIA1 gene shows the common double peak with depletion right at the transcriptional start site.

Contents & Storage

Please note that the ChIP-IT High Sensitivity Kit is shipped on dry ice and contains reagents with multiple storage temperatures inside. Please store each component at the temperature indicated below. All reagents are guaranteed stable for 6 months from date of receipt when stored properly. Do not re-freeze the Protein G Agarose Beads after you have received this kit. This kit includes the following components:

  • RNase A (10 µg/µl); Store at -20°C
  • Proteinase K (10 µg/µl); Store at -20°C
  • 100 mM PMSF; Store at -20°C
  • Protease Inhibitor Cocktail (PIC); Store at -20°C
  • Precipitation Buffer; Store at -20°C
  • Carrier; Store at -20°C
  • 10X PBS; Store at -20°C
  • Blocker; Store at -20°C
  • Fixation Buffer; Store at 4°C
  • Protein G Agarose beads; Store at 4°C
  • Stop Solution; Store at RT
  • Chromatin Prep Buffer; Store at RT
  • ChIP Buffer; Store at RT
  • Wash Buffer AM1; Store at RT
  • Elution Buffer AM4; Store at RT
  • ChIP Filtration Columns; Store at RT
  • 5 M NaCl; Store at RT
  • TE, pH 8.0; Store at RT
  • Detergent; Store at RT
  • DNA Purification Binding Buffer; Store at RT
  • 3 M Sodium Acetate; Store at RT
  • DNA Purification Wash Buffer; Store at RT
  • DNA Purification Elution Buffer; Store at RT
  • DNA Purification Columns; Store at RT

Please note that the High Sensitivity Chromatin Preparation Kit is shipped on dry ice and contains reagents with multiple storage temperatures inside. Please store each component at the temperature indicated below. All reagents are guaranteed stable for 6 months from date of receipt when stored properly. Do not re-freeze the Protein G Agarose Beads after you have received this kit. This kit includes the following components:

  • RNase A (10 µg/µl); Store at -20°C
  • Proteinase K (10 µg/µl); Store at -20°C
  • 100 mM PMSF; Store at -20°C
  • Protease Inhibitor Cocktail (PIC); Store at -20°C
  • Precipitation Buffer; Store at -20°C
  • Carrier; Store at -20°C
  • 10X PBS; Store at -20°C
  • Fixation Buffer; Store at 4°C
  • Swelling Buffer; Store at 4°C
  • Stop Solution; Store at RT
  • Chromatin Prep Buffer; Store at RT
  • ChIP Buffer; Store at RT
  • DNA Purification Elution Buffer; Store at RT
  • 5 M NaCl; Store at RT
  • TE, pH 8.0; Store at RT
  • Detergent; Store at RT

Some select publications are listed below.