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Nuclear Extract Kitの概要
Nuclear Extract Kitは、哺乳類の細胞または組織サンプルから高品質の核、細胞質または全細胞抽出物を調製できます。本キットを使用することで、試薬やプロトコールの最適化が不要となり、毎回高収率で抽出物を得られます。さらに重要なことは、このキットで抽出手順を標準化することで、より再現性の高い結果が保証されることです。抽出物は、EMSA、ウェスタンブロットおよび結合アッセイを含む様々なアプリケーションでの使用に適しており、弊社のTransAM® Transcription Factor Assaysのサンプルの調製にも非常に適しています。
Nuclear Extract Kitは、新鮮または凍結した細胞および組織サンプルいずれでも使用でき、細胞質抽出物(濃度1〜2 mg/ml)から約0.5～1 mg、核抽出物(濃度3〜5 mg/ml)から約150～250 μg、8.8 x 106個の細胞からの全細胞抽出物(濃度4〜8 mg/ml)から約1.2～2.4 mgのタンパク質を得られます。キットの手順は簡単で、2時間程で完了します。このキットには、タンパク質を保持するためのプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤に加え、溶解用のバッファー、界面活性剤などの試薬が含まれています。
適用
Nuclear Extract Kitを用いて得られた抽出物はアクティブ・モティフ社のTransAM® Kitsをはじめ,ゲルシフトアッセイ, ウェスタンブロッティング, DNAフットプリンティング等の解析や, 転写因子精製に使用することができます。
Nuclear Extract Kitの利点
- 再現性のよい結果が得られます。
- 条件検討を行う必要がありません。
- 抽出に必要な全ての試薬が含まれます。
- 核抽出物と細胞質抽出物, 全細胞抽出物を1つのキットで調製することができます。
NEキットで得た画分のウェスタンブロット
(クリックして拡大)
Nuclear Extract Kitの構成品
構成品 & 保存条件
Nuclear Extract Kitは、ドライアイスを入れて出荷しますが、キットには様々な保存温度の試薬等が含まれます。製品を受け取ったら各構成品は下記の温度で保存してください。全ての試薬等は、適切に保存された場合、受け取りから6ヶ月間保証します。
- 1 M DTT (Dithiothreitol); Store at -20°C
- Protease Inhibitor Cocktail (PIC); Store at -20°C
- Lysis Buffer AM1; Store at 4°C
- 10X PBS; Store at 4°C
- Phosphatase Inhibitors; Store at 4°C
- 10X Hypotonic Buffer; Store at 4°C
- Detergent; Store at 4°C
Nuclear Extract Kitのデータ
Nuclear Extract Kitを使用したときの細胞の分画効率を示すため、HeLa細胞から核、細胞質および全細胞抽出物を調製しました。また、核抽出物から核ペレットも取得しました。細胞画分は、各種タンパク質に対する抗体を用いたウエスタンブロットにより解析しました。図１に示すように、核のマーカーであるRNA pol IIや細胞質マーカーのTubulinのように細胞画分のマーカーとなるタンパク質は、それぞれの細胞画分と全細胞抽出物からのみ検出されました。また、膜関連のLamin A/Cやpan-Cadherin、ミトコンドリアCOX IV、GAPDHなどの他のタンパク質の局在も解析しました。
図1: Nuclear Extract Kitで得た各細胞画分に特異的なタンパク質のウェスタンブロット
細胞分画の効率を評価するため、20 μgの核(Nu)、細胞質(Cy)と全細胞(WC)抽出物および、NEキットを用いた核抽出の間に収集した核ペレット(NP)に対し、画分特異的なタンパク質に対するさまざまな抗体を用いてウェスタンブロットを実施した。一次抗体：alpha Tubulin (アクティブ・モティフCat. No. 39528)、COX IV、GAPDH、Lamin A/C (アクティブ・モティフCat. No. 39288)、RNA pol II (アクティブ・モティフCat. No. 39097)。
Nuclear Extract Kitの品質を実証するため、TNF-αで30分間処理または未処理のHeLa細胞から核抽出物と細胞質抽出物を調製しました。活性化されたNFκB は核内に移行するため、刺激した細胞の核抽出物には活性化された NFκB が含まれると考えられます。実際に、予想通りの結果が得られ (図2)、本キットの高い特異性が示されました。
図2: 核画分および細胞質画分の高品質抽出
Nuclear Extract Kitで核抽出物と細胞質抽出物を調製し, 各抽出物の NFκB 活性をTransAM® NFκB p50 Kitを用いて測定した。
アクティブ・モティフでは数多くの核抽出物(nuclear extracts)、 細胞質抽出物(cytoplasmic extracts)、 全細胞抽出物(whole-cell extracts)をご用意しています。これらの抽出物はNuclear Extract Kit内の試薬と同等の高品質な試薬を用いて抽出しています。TransAM Transcription Factor DNA-binding ELISA で, ポジティブコントロールとしてご使用いただける抽出物も多数ご用意しています。
Nuclear Extract Kitを使用した学術論文
Nuclear Extract Kitを使用したお客様が発表した論文をデータベースから検索できます。
Nuclear Extract Kitの技術資料
