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ToxCount™ Cell Viability Assay は2色の蛍光を用いて細胞生存率を測定するアッセイです。カルセインAM およびエチジウムホモダイマー(EthD-1:ethidium homodimer)を用いて細胞の生死を同時に検出できます。両方の色素は細胞に加えるまでは非蛍光性のため, バックグラウンドが非常に低く抑えられます。
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ToxCount の原理
ToxCountでは2種類のプローブ, calcein AM およびエチジウムホモダイマー(EthD-1 : ethidium homodimer) を用いて細胞の生死を検出します。カルセインAMは非蛍光の細胞膜透過性色素で, 生細胞の細胞内のエステラーゼによって切断され, 緑色の蛍光を発する性質を持ちます。エチジウムホモダイマー(EthD-1)は核や染色体を染色し, 赤色の蛍光を発します。この色素は生細胞の細胞膜を透過することができないため, 通常死細胞の検出に用いられます。ToxCountで用いられる色素は細胞に反応させる前は非蛍光の性質をもつため, バックグラウンドを最小限に抑える事ができます。ToxCountはMolecular Devices 社のIsoCyte™ レーザースキャナ (図 1)もしくは標準的な蛍光顕微鏡を用いて解析する事ができます(図 2)。
ToxCountの利点
- 再現性のよい結果が得られます。
- 迅速かつ簡便なプロトコールです。
- 毒性のない試薬を使用しています。
- 経済的です。
- ハイスループット対応です。
図 1: IsoCyteを用いたToxCountデータの解析
図 2: 蛍光顕微鏡を用いたToxCountデータの解析
カルセインAM (0.5 mM)および EthD-1 (0.5 mM) でCHO細胞を染色し, 蛍光顕微鏡で観察した。薬剤非処理の生細胞は上に, 70%メタノール処理した細胞は下に示した。顕微鏡対物レンズは20倍, シャッタースピードはcalcein AMの場合は 1秒, EthD-1の場合は 2秒で撮影した。
