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5hmC Profiling Kitの概要
特許取得済みの5hmC-Seal技術*に基づく5hmC Profiling Kitのプロトコールは、5-ヒドロキシメチルシトシン（5-hmC）を含むDNA断片を検出・捕捉し、リアルタイムPCRまたはNGSシーケンシングの解析で利用できるように設計されています。方法は、まずβ-グルコシルトランスフェラーゼ酵素を利用することにより、修飾されたグルコース部分が二本鎖DNA中の5-hmC残基に選択的に転移されます。次に、この修飾グルコースを用いてビオチン結合体を化学的に結合させ、ストレプトアビジン磁気ビーズで5-hmC含有断片を捕捉・濃縮します。すべてのDNAの精製工程は、便利なSPRIビーズを用いて行われます。
5hmC Profiling Kitには、グルコシル化およびビオチン化反応、ストレプトアビジン捕捉、溶出、5-hmCを含むDNAの精製を行うために必要なすべての試薬が含まれています。さらに、濃縮の効率と特異性を検証できるように、Spike-inコントロールDNAとPCRプライマーも含まれています。
* Song, C.X., et al., Nature Biotechnology. 29, 68-72 (2011).
Patent US 8,741,567 B2.
5hmC Profiling Kitの特長
- 高い選択性： 5-mCとの交差反応なしで、 5-hmCのみを化学的に修飾することが可能
- 低いバックグラウンドと高い感度： ビオチン-ストレプトアビジンの強力な結合を使って、hMeDIPよりも、強い洗浄が可能
- 品質確認コントロールを含む： Spike-in コントロールDNAとPCRプライマーをキットに含むため、5-hmCの濃縮効率と選択性の確認が容易にできる
- 簡単で迅速： 作業は、５時間以内
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5hmC Profiling Kitの構成品
5hmC Profiling Kitはドライアイスで出荷されますが、構成品は異なる保存温度の試薬が含まれています。製品受領後、各試薬は下記の温度で保存してください。すべての試薬は適切に保管された場合、受取日より6ヶ月間の安定性が保証されています。Streptavidin BeadsやSPRI Beadsは再凍結しないでください。解凍後は適切な温度で保存してください。本キットには以下の構成品が含まれています：
| Reagents | Quantity | Storage |
|---|---|---|
| Beta-glucosyltransferase | 55 µl | -20°C |
| UDP-Azide-Glucose | 65 µl | -20°C |
| 10X Reaction Buffer | 140 µl | -20°C |
| Biotin Conjugate Solution | 500 µl | -20°C |
| Spike-in DNA (10 ng/µl) | 55 µl | -20°C |
| 5hmC Spike-in Primer | 160 µl | -20°C |
| 5mC Spike-in Primer | 160 µl | -20°C |
| Streptavidin Beads | 620 µl | 4°C |
| Binding Buffer AM13 | 28 mL | 4°C |
| 10X Elution Buffer AM2 | 140 µl | 4°C |
| SPRI Beads | 4.5 mL | 4°C |
| TT Buffer | 3.6 mL | RT |
| 10 mM Tris-HCl, pH 8 | 11 mL | RT |
5hmC Profiling Kitデータ
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図 1: 5-hmC DNA の濃縮に対する 5hmC Profiling Kit の特異性
超音波処理した310 ngのマウス脳ゲノムDNAに31 pg（1:10,000）の陽性コントロールSpike-in DNAを添加し、5hmC Profiling Kitプロトコルを用いてtriplicateで処理した。溶出・精製されたDNAは、3種類のマウス特異的プライマーセット（Agap1、Necap1、Ppm1h）および同梱の5hmCおよび5mC Spike-in Primerセットを用いてリアルタイムPCRを行った。濃縮反応の効率と選択性を決定するために、% Inputを計算した。 Agap1、Necap1、Ppm1hプライマーセットは、5-hmCを含むことが知られているそれぞれの遺伝子内の領域をターゲットとしている。Spike-in DNA (10 ng/µl)は、5-メチルシトシン(5-mC)または5-ヒドロキシメチルシトシン(5-hmC)を含む2つの異なるdsDNA断片の等モル混合物を含む。5hmCおよび5mC Spike-inプライマーセットは、それぞれこれらの5-mCまたは5-hmC dsDNA断片をターゲットとする。ライブラリー調製やシーケンスに進む前の濃縮効率は、これらのスパイクインを使ったqPCR法で決定できる。ネガティブコントロールは、ヒドロキシメチルシトシンを含まない領域に対して実施した。
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図2: 10 ngまでのインプットゲノムDNAの量とピークの良好な相関
PIXULで断片化したマウス脳gDNAを、5hmC Profiling Kitのプロトコルを用いて、2.5 µg、80 ng、40 ng、10 ngのインプット量で処理した。キットで得られた断片からライブラリーを作成し、各サンプルの5-hmCの局在を決定した。1番染色体の代表的な22 Mbのサンプルでは、すべての入力量の間に良好な相関が見られた。
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図3：得られたデータは、公表されているデータと良好な相関を示した
PIXULを使って断片化したマウス脳ゲノムDNA 2.5μgを、5hmC Profiling Kitのプロトコルを用いて処理した。5-hmCを濃縮した断片からライブラリー調製を行い、塩基配列を決定した。hMe-SealのデータはSong et al., Nature Biotech, 2011で公開されているものを並べた。
5hmC Profiling Kitの技術資料
