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CUT&Tag-IT® Assay Kit - Tissueの概要
サンプルが細胞の場合には、CUT&Tag Kits for cellsをお使いください。細胞用、組織用のどちらのキットも、CUT&Tag検証済み抗体の利用を推奨しています。
pA-Tn5 Transposaseのバルク注文はこちら
16サンプル以上のマルチプレックスをご希望の場合には、Nextera™-Compatible Multiplex Primers (96 plex) をご利用ください。
Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag)は、ゲノムにおけるヒストン修飾や転写因子の局在を調べるための方法です。タンパク質とDNA間の相互作用を明らかにしたり、標的タンパク質のDNA結合部位を同定したりすることができます。
クロマチンアクセシビリティ依存的にオープンクロマチン領域を標的とするMNase-SeqやATAC-Seq法とは異なり、CUT&Tagは抗体を使って酵素 (Tn5) を標的領域に誘導する方法で、ヒストン修飾や転写因子などの標的タンパク質に特異的なゲノムやクロマチンへの結合情報を明らかにすることが可能です。
CUT&Tagは、抗体を用いるなどのChIP-Seqと同じ原理に基づいていますが、プロトコルにいくつかの変更が加えられています。標準的なChIP-Seqで行われるホルマリン固定したクロマチンの超音波処理（断片化）と免疫沈降のステップの代わりに、CUT&Tagでは、まず新鮮な（非凍結）未固定細胞（または核）をコンカナバリンAビーズで捕捉し、ネイティブ状態の細胞（核）と抗体のインキュベーションを行います。抗体を結合させた後、シーケンスアダプターをあらかじめ導入したプロテインA結合Tn5トランスポゾーム酵素 (pA-Tn5) を用いたタグメンテーションにより、クロマチンの断片化とNGSライブラリー調製をワンステップで実行します。
CUT&Tagは、ChIP-Seqよりも少ないサンプルから高品質な結果を迅速に得ることが可能であり、深度の浅いシーケンスで十分な解析ができるため、時間と費用の両方を抑えることができます。
CUT&Tag-IT® Assay Kit - Tissue Advantage
- 0.5～10mgの組織サンプルに対応
- 組織からの核分離のための専用溶解液を含む
- 核分離用のストレーナーを含むオール・インワンキット
- ヒストンマーク用に開発され、各種ヒストン修飾解析で検証済み
- ChIP-Seqにおける手間とコストのかかる工程を排除したNGSライブラリー調製
- 低バックグランドシグナルが可能にする深度の浅いシーケンス
- ホルマリンを使用せずネイティブな標的タンパク質を用いた解析
How the CUT&Tag-IT® Assay Works
CUT&Tag vs. CUT&RUN vs. ChIP-Seq
| CUT&Tag | CUT&RUN | ChIP-Seq | |
|---|---|---|---|
| ネイティブ条件で実施？ | はい | はい | いいえ |
| クロマチンの断片化法 | Tn5を用いたタグメンテーション | MNaseによる消化 | ソニケーション |
| 細胞数 | ~250,000 nuclei | 500,000 cells | 1-10 million cells |
| シーケンス深度 * | 2 million reads ** | 8 million reads † | 20-50 million reads |
| ライブラリー調製キットの必要性 | なし。タグメンテーションを利用 | あり。別工程で実施 | あり。別工程で実施 |
| 適用可能な標的 | 主なヒストン修飾、いくつかの転写因子およびコファクター | 主なヒストン修飾、いくつかの転写因子およびコファクター | 幅広いヒストン修飾、転写因子およびコファクター |
| 作業時間 | 1-2日 | 1-2日 | 2-3日 |
* Kaya-Okur et al. Nature Communications (2019) 10:1930
** For less abundant targets of interest, 8 to 10 million reads are recommended
† 25 million reads are recommended for transcription factor targets
CUT&Tag-IT® Assay Kit - Tissueの構成品
CUT&Tag-IT® Assay Kit -Tissueは、温度帯の異なる2つの箱で出荷されます。-20℃保管となる構成品はドライアイスとともに、凍結不可で4℃保管とすべき構成品は室温でのお届けとなります。開封後、すべての試薬等はマニュアルに記載の適切な条件で保管してください。適切に保管された場合、受け取り日から6ヶ月間安定であることを保証します。
Reagents included:
- 5% Digitonin, store at -20°C
- CUT&Tag-IT Lysis Buffer – Tissue, store at RT
- 40 µm Strainer, store at RT
- Concanavalin A Beads, store at 4°C
- CUT&Tag-IT® Assembled pA-Tn5 Transposomes, store at -20°C
- Tagmentation Buffer, store at -20°C or 4°C
- 1X Binding Buffer, store at 4°C
- 1X Wash buffer, store at 4°C
- Dig-Wash Buffer, store at 4°C
- Antibody Buffer, store at 4°C
- Dig-300 Buffer, store at 4°C
- Rabbit Anti-Mouse Antibody, store at -20°C
- Guinea Pig Anti-Rabbit Antibody, store at -20°C
- Protease Inhibitor Cocktail, store at -20°C
- 0.5M EDTA, store at RT
- 10% SDS, store at RT
- 10 µg/µL Proteinase K, store at -20°C
- DNA Purification Columns, store at RT
- DNA Purification Binding Buffer, store at RT
- DNA Purification Wash Buffer, store at RT
- DNA Purification Elution Buffer, store at RT
- 3M Sodium Acetate, store at RT
- 10 mM DNTPs, store at -20°C
- 5X Q5 Buffer, store at -20°C
- Q5 High Fidelity DNA Polymerase (2U/µL), store at -20°C
- i5 Indexed Primer 1, store at -20°C
- i5 Indexed Primer 2, store at -20°C
- i5 Indexed Primer 3, store at -20°C
- i5 Indexed Primer 4, store at -20°C
- i7 Indexed Primer 1, store at -20°C
- i7 Indexed Primer 2, store at -20°C
- i7 Indexed Primer 3, store at -20°C
- i7 Indexed Primer 4, store at -20°C
- SPRI Beads, store at 4°C
CUT&Tag検証済み抗体をご使用ください！
アクティブ・モティフは、ヒストンやヒストン修飾、クロマチンタンパク質の他、多様な因子に対する高品質な抗体を製造しており、CUT&Tagアッセイにおいて良好な結果が得られることを検証した抗体も数多く取り揃えていますのでCUT&Tag検証済み抗体をご確認ください。
CUT&Tag-IT® Assay Kit – Tissueで得られたデータ
(Click image to enlarge)Figure 1: CUT&Tag-IT Assay Kit - Tissueによる、各種サンプルの解析結果
各組織（肝臓、腎臓、心臓、脾臓、脳）10 mgを使って、H3K27me3（商品コード39155）とCUT&Tag-IT Assay Kit - Tissueを使った解析。HOXクラスター領域をゲノムブラウザーで表示した例。
(Click image to enlarge)Figure 2: CUT&Tag-IT Assay Kit - Tissueによる、各種ヒストン修飾の解析結果
脾臓 2 mgを使って、H3K27ac (cat. no. 39133), H3K4me3: cat. no. 39159 とH3K27me3 (cat. no 39155)を使って解析した。Nkx2領域をゲノムブラウザーで表示した例。
(Click image to enlarge)Figure 3: CUT&Tag-IT Assay Kit - Tissueによる、マウス心臓の解析結果
マウス心臓 0.5 - 10 mgを使って、H3K27me3 (Cat No. 39155) とCUT&Tag-IT Assay Kit - Tissueを使った解析。解析はTrpricateで実施し、再現性が高いことがわかる。
CUT&Tag-IT® Assay Kit - Tissue FAQs
組織サンプルをどのように破砕すればよいですか?
(Click image to enlarge)マウス肝臓サンプルを処理する手順と写真
Step 1: 臓器を切り出す
Step 2: プレートを氷上において、カミソリ等を使って小さく刻む
Steps 3 & 4: プレートの角などを使ってなるべく細かく組織を破砕する
Step 5: 塊がなくなるまで細かく刻む
Step 6: プレートの側面に集める
Step 7: 1 mlのチップの先端を切ったものを用意する
Step 8: 先端を切ったピペットで液体を出し入れし、さらに細かくする
Step 9: チューブにストレイナーをセットし、サンプルをろ過して回収する
CUT&Tag-IT® Assay KitにはCUT&Tagの実験に必要なものが全部含まれますか?
はい。このキットにはpA-Tn5トランスポゾームを必要なもの含むすべてが入っています。他に必要なものは一般的な実験室にある機器と英文マニュアルの”Additional Materials Required”に記載された試薬類のみです。
CUT&TagとChIP-Seqは、どう違うのですか?
CUT&TagはChIP-Seqと以下の点が異なります
- 細胞のホルマリン/ホルムアルデヒドによる固定が不要
- ソニケーションなどによるクロマチンの断片化が不要
- より少ない細胞でも実施可能
- ライブラリー調製まで簡単
- 低バックグラウンド
- 浅いシーケンス深度で解析可能
どのような時にChIP-SeqよりもCUT&Tagを選べばいいですか?
CUT&Tagは限られた細胞数しか得られないようなサンプルで、ゲノムワイドなヒストン修飾を調べる場合に最適な選択です。通常の転写因子の研究にはChIP-Seqを推奨します。
CUT&Tag-IT® Assay Kitにおすすめのコントロールは?
手技および試薬類に対するポジティブコントロール抗体としてH3K27me3 (cat# 39157)が使用できます。ネガティブコントロールとしては、一次抗体を使用せず、二次抗体のみの反応を行うことを推奨します。これにより、使用した細胞に対する二次抗体とpA-Tn5のバックグラウンドレベルを知ることができます。
IgGコントロールは必要?
CUT&Tagの実験においてIgGコントロールをおく目的は、一次抗体が濃縮した特定のゲノム領域にpA-Tn5が特異的に分布するかを確認するためであり、ChIP-Seqにおけるインプットコントロールとは異なります。そのため、CUT&TagではIgGコントロールは必須ではありません。アクティブ・モティフのR&Dチームは、pA-Tn5の特異性が高く、IgGコントロールを使用した実験が付加的な価値を産まないことを確認しています。もちろん、IgGコントロールの実験を行うことは問題ありません。
CUT&Tag-IT® Assay Kitで推奨するQCステップはありますか?
ライブラリー調製後、テープステーションやバイオアナライザーを用いてライブラリーの品質を確認すべきです。理想的なライブラリーは、ほとんど500 bp以下です。ライブラリー濃度の決定にはKAPA Library Quantification Kitの使用を推奨します。
CUT&TagではChIP-Seqのように INPUTコントロールは必要ですか?
いいえ。CUT&Tagはinputコントロールを必要としません。
CUT&Tag-IT® Assay Kitでの使用が検証された抗体はありますか?
CUT&Tag-IT® Assay Kitで検証済みの弊社の抗体は下のリンクをご参照ください: https://www.activemotif.com/catalog/1319/cut-tag-validated-antibodies
ChIP-Seq検証済み抗体はCUT&Tag-IT® Assay Kitでも使用可能ですか?
CUT&TagとChIP-Seqは抗体反応条件が異なります。このため、ChIP-Seqで使用できてもCUT&Tagで使用できるとは限りません。ただしアクティブ・モティフの CUT&Tag-IT® Assay Kit検証済み抗体がない場合には、ChIPグレード、 ChIP検証済みと表示のある抗体を試されるのは良い選択です。
CUT&Tag-IT® Assay Kitはモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でも使用可能ですか?
はい。どちらでも使用可能です。ただし、キットの二次抗体に対応する抗体（ウサギまたはマウス）をご使用ください。
CUT&Tagはタグを付けたタンパク質でも適用可能ですか?
弊社ではCUT&Tag-IT® Assay Kitを用いてタグ付きタンパク質とタグに対する抗体を使った検証を行っていませんが、原理的に可能と考えられます。
アクティブ・モティフで販売しているSpike-In標準化法はCUT&Tag-IT® Assay Kitでも利用可能ですか?
いいえ。ChIP-SeqのSpike-In標準化法はCUT&Tag-IT® Assay Kitとは互換性がありません。
CUT&Tag-IT® Assay Kitで16種類以上のマルチプレックスは可能ですか?
CUT&Tag-IT®Assay Kitには、4x4個のユニークデュアルインデックスが付属されており、最大16サンプルのマルチプレックスが可能です。キット内のインデックス付きプライマーは、N701-N704およびN501-N504に対応するイルミナ社製 Nexteraプライマーと同一の配列です。16サンプル以上のマルチプレックスをご希望の場合は、Nextera™-Compatible Multiplex Primers (96 plex) kit (Cat. No. 53155) により、最大96サンプルまでマルチプレックスが可能となります。これらのプライマーは25 µMの濃度で提供され、当社のキットに直接使用することができます。また、他のイルミナ社製 Nexteraプライマーを購入し、キット内のプライマーと同じ濃度 (25 µM) で組み合わせて使用することも可能です。
CUT&Tag-IT® Assay Kitはシーケンス前にqPCR解析が可能ですか?
可能とも不可能とも言えません。qPCRは可能かもしれませんが、Tn5によるアダプターの挿入はランダムであり、またChIP-Seqで得られる断片よりも短いため、設計したプライマーセットの両端まで維持された断片は少ないと考えられます。このため、片側のプライマーしかアニールしない断片は増幅されないため、誤差を含む可能性があります。
CUT&Tag-IT® Assay Kitのライブラリーはシングルインデックス、それともデュアルインデックス?
CUT&Tagライブラリーはデュアルインデックスです。
CUT&Tag-IT® Assay Kitのライブラリーには分子バーコードが含まれますか?
いいえ。CUT&Tagライブラリーは分子バーコードを含みません。
CUT&Tag-IT® Assay Kitのライブラリーは、シングルエンドとペアエンドのどちらでシーケンスすべきですか?
The CUT&Tag-IT® Assay Kitで調製されたライブラリーは、ペアエンドをご使用ください。
CUT&Tag-IT® Assay Kitを使用するときのおすすめのリード長は?
38塩基長のペアエンド (PE38)を推奨します。この手法を開発したDr. Henikoffの研究室のプロトコールよりも短いですが、データの質やマッピングレートに影響がないことを確認しています。もちろん、より長いリード長を使用することも可能です。
CUT&Tag-IT® Assay Kitを使って得られたシーケンスデータは、どのように解析すれば良いですか?
CUT&Tagのシーケンスデータは、ChIP-seqと同様に解析します。弊社ではMACS2を用いてピークコールを行うBWAアルゴリズムを採用しています。
ライブラリー断片サイズの品質や対処法については、ATAC-SeqおよびCUT&TagのためのライブラリーQCをご参照ください。
CUT&Tag-IT® Assay kit - Tissueの資料
こちらもご参照ください：
- CUT&Tag Kit for Cell Samples
- [Podcast] Multiple challenges of CUT&Tag
- 完全ガイド：CUT&Tagアッセイの理解と使用法
- End-to-End CUT&Tag Service
- ATAC-Seq Kit
- エピジェネティクス受託サービス
- 学術・技術情報
US Pat. No. 10,689,643, EP Pat. No. 2999784 and related patents and applications
Permitted Use; Resale Prohibited
In the absence of an express written agreement to the contrary, all products are sold and services deliverables are provided by Active Motif for (a) internal in vitro research purposes only and may not be used for services or any other commercial purpose (b) the exclusive use of the original purchaser, and are not to be resold. You agree not to reverse engineer or otherwise attempt to discover the structure or composition of products or services deliverables unless we otherwise agree in writing.
| Name | Format | Cat No. | Price | |
|---|---|---|---|---|
| CUT&Tag-IT® Assay Kit - Tissue | 16 rxns | 53170 | ¥242,000 | Buy |
