ChIP-Seq Spike-in標準化受託サービス

Spike-in 標準化法による新たなChIP-Seq定量的解析

 

ChIP-Seq Spike-in標準化受託サービスの概要

Spike-In

従来のChIP-Seqプロトコルに共通する問題は、低分子エピジェネティック阻害剤処理で生じる、ヒストン修飾のグローバルな変化を必ずしも検出できないことでした。

アクティブ・モティフでは、この問題を解決する「Spike-in 標準化法」を開発しました。このSpike-In標準化法は、アクティブ・モティフのend-to-end ChIP-Seq受託サービスのオプションとして提供しています。

または、japantech@activemotif.comまでお問合せください。

ChIP-Seq Spike-in標準化法とは?

標準的なChIP-Seqプロトコルにひと手間加えることで、アッセイをより定量的にし、ゲノム全体のヒストン修飾や転写因子などの結合プロファイルのグローバルな変化を同定することができます。

ChIP-Seq Spike-in標準化法は、実験サンプル (例: ヒトのクロマチン) と標的抗体を用いて標準的なChIP反応をセットアップすることから始まります。そこへ、キイロショウジョウバエのクロマチン (Spike-inクロマチン) を各サンプルにごく少量「スパイクイン」 (添加) します。キイロショウジョウバエ特異的なヒストンH2Avを認識する抗体 (Spike-in Antibody) と共に免疫沈降することによって、全てのサンプルで一貫して、Spike-inクロマチン由来のDNAを得ることができます。ChIP-Seqのシーケンス情報は、キイロショウジョウバエゲノムと実験サンプルゲノムの両方にマッピングされます。クロマチン免疫沈降の効率を補正する標準化係数は、Spike-inのシグナルに基づいて作成され、実験サンプルのシグナルを標準化することができます。

Flow Chart of the ChIP Normalization Strategy for ChIP-Seq from Active Motif
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詳細については、Spike-in標準化技術に関するPLoS One の論文をご参照ください。
Egan B, Yuan C-C, Craske ML, Labhart P, Guler GD, Arnott D, et al. (2016) An Alternative Approach to ChIP-Seq Normalization Enables Detection of Genome-Wide Changes in Histone H3 Lysine 27 Trimethylation upon EZH2 Inhibition. PLoS One 11(11): e0166438. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0166438

 

ChIP-Seq Spike-in標準化受託サービスのデータ

次世代シーケンサーのライブラリー増幅やシーケンスの際に生じるバイアスは、ショウジョウバエのSpike-inクロマチンでも発生します。しかし、アクティブ・モティフのSpike-in標準化法を用いることによって、これらのバイアスを縮小し、ChIP-Seq解析でサンプルに存在する重大な生物学的変化を明らかにすることができます。

ChIP-Seq Spike-in Normalization Strategy reveals changes in H3K27me3 levels following treatment with EZH2 inhibitor compound.
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図1. ChIP-Seq Spike-in 標準化法により、EZH2阻害剤処理によるH3K27me3レベルの変化が明らかになった

EZH2メチル化酵素の低分子阻害剤で処理した細胞は、グローバルなH3K27me3レベルの劇的な減少を示す。しかし、標準的なChIP-Seqプロトコルを用いたH3K27me3 ChIP-Seq (−) では、これらの差は検出されない 。アクティブ・モティフのChIP-Seq Spike-in標準化法を用いたプロトコル (+) により、H3K27me3 ChIP-Seqシグナルが予想通り減少することが分かる。

 

ChIP-Seq Spike-in標準化受託サービスの論文使用実績

論文実績データベースから、ChIP-Seq Spike-in標準化受託サービスの使用例が検索可能です。


 



 

ChIP-Seq Spike-in標準化受託サービスの資料

 

 

こちらもご参照ください

 

How does it work?

ChIP-Seq reactions:

  • A standard ChIP-Seq reaction is set up using experimental chromatin (e.g. human) and an antibody of interest (e.g. H3K27me3 antibody).
  • In addition, Drosophila melanogaster chromatin is added, or “spiked-in”, to each reaction as a minor fraction of total chromatin.
  • An antibody that recognizes the Drosophila-specific histone variant, H2Av, is also added to the reaction, which provides a mechanism to reliably pull down a small fraction of Drosophila chromatin.
  • Following ChIP, immunoprecipitated DNA sequences are analyzed by Next-Generation Sequencing (NGS).

Data Analysis & Normalization

Once Next Generation sequencing is completed ...

  • Align sequence tags to the experimental reference genome (e.g. human) and the Drosophila genome.
  • Equalize differences in Drosophila tag counts across samples.
  • Count Human tags and then normalize using the same ratio used to equalize Drosophila tag counts.

Results

Biases that are introduced during Next-Generation library amplification and sequencing also occur with the Drosophila spike-in chromatin. However, normalization using our Spike-in strategy eliminates these biases, enabling ChIP-Seq analysis to reveal any significant biological changes present in your samples.

ChIP-Seq Spike-in Normalization Strategy reveals changes in H3K27me3 levels following treatment with EZH2 inhibitor compound.
Figure 1: ChIP-Seq Spike-in Normalization Strategy reveals changes in H3K27me3 levels following treatment with EZH2 inhibitor compound.

Cells treated with small molecule inhibitors of the EZH2 methyltransferase have dramatic reductions in global H3K27me3 levels. However, H3K27me3 ChIP-Seq using standard ChIP-Seq protocols do not detect these differences (indicated by the - label above). Incorporation of Active Motif’s ChIP-Seq Spike-in strategy reveals the expected decrease in H3K27me3 ChIP-Seq signal (indicated by the + label above).