インタラクトーム解析(RIME/ChIP-MS)

質量分析によるタンパク質相互作用解析

RIME (Rapid Immunoprecipitation Mass spectrometry of Endogenous proteins) またはChIP-MS (Chromatin Immunoprecipitation with Mass Spectrometry) は近年開発された転写コファクターとクロマチン関連タンパク質の識別を行うための技術です。

RIME Method
RIME は, Cell Reports で発表されました。

What our customers are saying about us...

I have ordered RIME/ChIP-MS services. Since the target antibody was first tested by the Antibody Validation Service, I felt confident in proceeding with the main test. The technical staff explained the data and were willing to repeatedly answer my questions. This service provided me with valuable information and helpful support from all the staff members at Active Motif.

Naoko Hattori, PhD
Staff Scientist
Division of Epigenomics,
National Cancer Center Research Institute,
Tokyo, Japan


この度、RIME/ChIP-MSの受託サービスを利用しました。前試験で抗体性能をテストできたおかげで、自信をもって本試験を依頼できました。解析結果に関しては、詳細なご説明がいただけ、何回もの質問にも快く答えてもらえました。Active Motif社のスタッフの手厚いサポートのもと、信頼できる結果が得られる、とても有意義なサービスと感じました。

服部奈緒子 先生
国立がん研究センター研究所 エピゲノム解析分野

RIME サービスの内容:

  1. 核の単離およびソニケーション
  2. 免疫沈降
  3. タンパク質の精製およびトリプシン消化
  4. 質量分析
  5. データ解析

ご興味をお持ちの方は,エピジェネティクスサービス リクエストフォーム に必要事項を記入してください。エピジェネティクス受託サービスの概要については Epigenetic Services Profile をご覧ください。

RIME 解析手法はこの Cell Reports で発表されました。 

日本語チラシはこちら

 
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RIME 25067 Get Quote

質量分析の技術を利用したRIMEは、ホルムアルデヒドで固定化した細胞から、免疫沈降したタンパク質の結合タンパク質を網羅的に同定する手法です

細胞をクロスリンクするメリット:

  1. 強力な結合を形成することで、洗浄を強力に行えるため、非特異的な結合などのバックグラウンドの低減が可能
  2. 洗浄により分離してしまうような弱い結合タンパク質も同定可能
  3. 遺伝子調節に関与するが、標的タンパク質との直接相互作用によって機能しない隣接するDNA結合タンパク質も捕捉可能

RIMEでわかること:

  1. 転写因子、コファクター/共役因子の同定
  2. エピジェネティックな修飾関連タンパク質複合体の同定
  3. 結合が弱いタンパク質の同定
  4. タンパク質相互作用ネットワークのマッピング
  5. ChIP-Seqにより同定されたタンパク質を検証し、RIME標的タンパク質と相互作用する因子のゲノム上のマッピング
  6. 共役因子の遺伝子発現調節への役割について知見
  7. 隣接する領域における転写因子結合とともに起こる顕著な変化を同定

     

 

RIME Venn Data
図1:MCF7細胞にRIMEを適用して描かれたベン図

RNAポリメラーゼII型を構成するサブユニットの一つPOLR2Aと相互作用するタンパク質を同定するためにRIMEを実施しました。MCF7細胞からそれぞれ500 µgと50 µgのクロスリンクした染色体を調製し、抗POLR2A抗体を用いてそれぞれ免疫沈降を行いました。沈降したタンパク質を質量分析法により解析した結果を示します。このベン図は、初期値が10倍異なるサンプルを用いた実験においても、6割前後が共通したことを示しています。


RIME POLR2A Coverage

RIME GO data

応用例:RIME and ChIP-Seq

BRD4を標的タンパク質としてRIMEを実施し、相互作用のあるタンパク質としてTOP2Aが同定されました。そこで、実際にBRD4およびTOP2Aが、ゲノムDNA上で共局在することを確認するため、これらを標的とするChIP-Seqを実施しました。このように、ChIP-Seqを用いたRIMEデータの拡張は、異なる転写因子を必要とする遺伝子サブセットの解明または、RIMEで同定された補助因子が同一遺伝子のエンハンサー領域等に共局在することを明確にするのに役立ちます。

ChIP-Seq shows co-localization of TOP2A and BRD4 binding sites.

 

ChIP-Seq shows co-localization of TOP2A and BRD4 binding sites.
図1&図2:ChIP-SeqはTOP2AとBRD4の結合部位が共局在することを示す

RIMEにより同定された、BRD4と相互作用するタンパク質TOP2Aの結合サイトをマッピングするため、ChIP-Seqを行いました。TOP2AおよびBRD4の結合サイトを図に示します。両タンパク質はゲノム上の多くの部位で共局在することが確認されました。図の上段(図1)は1番染色体上の結合サイトを示し、下段(図2)は3番染色体の結合サイトを示します。