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転写因子NFκB

転写因子NFκB (NF kappa B, NF- κB, またはnuclear factor κB)は、炎症、細胞増殖、細胞の生存を調節する遺伝子の制御に関わることから幅広く研究されています。 NFκBは、TNF(Tumor Necrosis Factor)や、IL-1 (interleukin-1)などのサイトカイン、フリーラジカル、紫外線照射、ストレス、細菌・ウイルスなどの刺激に対する細胞の暴露により活性化されます1-3。

Diagram of NFkB activation.

Diagram of NFκB activation.

NFκBは、異なるサブユニットのホモまたはヘテロ二量体として構成されます。これらのサブユニットは、構造的に関連するRelファミリー転写因子のメンバーです。5つの異なるRelタンパク質(Rel/ NFκBタンパク質とも呼ばれます)が同定されています：p50 (NF-κB1), p52 (NF-κB2), p65 (RelA), RelB and c-Rel4。p50/p65ヘテロ二量体は、ほとんどの細胞に見られる主要なRel/NFκB複合体です。Relタンパク質は、Relホモロジードメイン(RHD)と呼ばれるN末領域を持ち、ファミリーのタンパク質間で保存されており、DNAの結合と二量体化に重要です。

RelB/NFκBは一般に二つのグループとして記述されます：RelA、RelBおよびc-RelはC末側に転写活性化ドメイン(transactivation domain: TD)をもち、活性化したNFκB複合体が核に移行するのに必要です。対照的にp50とp52は転写活性化ドメインを持ちません。自身では転写を活性化できないため、転写を活性化するためにはRelA、RelB、c-Relとヘテロ二量体を形成する必要があります。p50およびp52のホモ二量体は、in vivoにおいてもκB配列依存的な転写を抑制することが報告されていますが、おそらく他の転写活性を持つ二量体(例えばp50/p65)とDNAの結合を競合阻害していると考えられています5。 NF-κB1およびNF-κB2は、それぞれ前駆体のp105およびp100からプロセシングにより生成されます。p105前駆体が恒常的にプロセシングを受けて成熟サブユニットp50を生成するのに対し、p100のプロセシングは厳密な調節を受けて成熟サブユニットp52を生成します6, 7。

不活性化型のNFκB二量体は、抑制性タンパク質であるIκBにより細胞質内に留められます。IκBタンパク質は、6回以上のアンキリンリピートが続くN末端調節ドメインを持つタンパク質ファミリーの1つです。これらのアンキリンリピート配列はNFκBタンパク質のRHDと相互作用して、それらの核移行シグナルをマスクすることにより移動を妨げます8。 IκBファミリーにはIκBa、IκBb、IκBeおよびBcl-3が含まれいます。

NFκBの活性化はp65 (RelA)のアセチル化により内部で起こり、通常は218、221または310番目のリジン残基で起こります。アセチル化されたNFκBは活性化され、IκBの抑制作用に抵抗を示します。外部の誘導物質によるNFκBの活性化には、IκBタンパク質のリン酸化と、それに伴う分解が必要です。IκBの調節ドメインに位置する2つのセリン残基Ser32とSer36におけるIκBキナーゼ(IKK)によるリン酸化は、阻害因子IκBのユビキチン化を誘導しプロテアソームにより分解されます。IKKは、酵素活性を持つIKKaとIKKbおよび調節性タンパク質NEMO (NFκB Essential Modulator)により構成されます。

炎症や細胞生存および細胞増殖時に活性化される遺伝子に加えて、NFκBは自身の抑制因子であるIκBaの発現も活性化させます。新生したIκBaはNFκBを再度抑制します。このようにして自己フィードバックが形成されます。この結果、NFκBの活性化レベルは振動します9。

References

  1. Gilmore, T.D. (2006) Oncogene 25: 6680-6684.
  2. Brasier, A.R. (2006) Cardiovasc. Toxicol 6: 111-130.
  3. Perkins, N.D. (2007) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8: 49-62.
  4. Nabel, G.J., Verma, I.M. (1993) Genes Dev. 7: 2063.
  5. Lernbecher et al. (1993) Nature 365: 767-770.
  6. Karin, M., Ben-Neriah, Y. (2000) Annu. Rev. Immunol. 18: 621-663.
  7. Senftleben et al. (2001) Science 293: 1495-1499.
  8. Jacobs, M.D., Harrison, S.C. (1998) Cell 95: 749-758.
  9. Nelson et al. (2004) Science 306: 704-708.

NFκBの機能解析をするためのアクティブ・モティフの製品

TransAM®転写因子活性測定ELISA

アクティブ・モティフのTransAMキットはELISAベースのDNA結合アッセイです。これにより哺乳動物の組織または細胞における転写因子活性化の研究をサポートします。TransAM法はRI不使用でながらゲルシフトアッセイ(EMSA)に比べて最大で100倍以上も感度が高く、5時間以内で終えることが可能です。

TransAM NFκBキットはNFκBコンセンサス結合部位を含む二本鎖オリゴヌクレオチドが固定された96 strip wellプレートを使用します。各ウェルに核または全細胞抽出物を添加すると活性化NFκBがオリゴヌクレオチドと特異的に結合します。その後、 p50、p65、p52、RelBまたはc-Relに対する一次抗体を加えます。そしてHRP標識二次抗体および現像試薬を順次加えて反応させ検出します。比色法のTransAMは分光光度計を用いて測定するのに対し、より高感度な化学発光法のTransAMはルミノメーターを用います。これによりNFκBの活性を定量的に測定します。検量線の作成用に、p65およびp50のリコンビナントタンパク質も別途ご購入いただけます。

詳細はTransAM転写因子活性測定ELISAの情報をご参照ください。

Gelshift™ Chemiluminescent EMSA

アクティブ・モティフでは、TransAM法はEMSAよりも優れていると考えておりますが、NFκBを含む転写因子のDNA結合活性を調べるためのシンプルかつ非RIのオプションとしてGelshift Chemiluminescent EMSAキットも提供しております。

詳細はGelshiftアッセイのページをご参照ください。

FACE™ cell-based ELISAs

FACE (Fast, Activated Cell-based ELISA)キットは、リン酸化により活性化されたタンパク質を、細胞ベースで測定するキットです。このin-cellウェスタン法では96ウェルプレートで細胞を培養し、目的の経路を活性化するために刺激を与えます。刺激後、細胞はリン酸化のような活性化特異的なタンパク質の修飾を保持するために固定されます。各ウェルのサンプルは、トータルNFκBやphospho- NFκB Ser468またはphospho- NFκB Ser536などの目的タンパク質に特異的な一次抗体とインキュベーションします。続いてHRP標識二次抗体および現像液とインキュベーションすることにより、比色法または化学発光法で再現性の高い定量が行えます。NFκBの他にも20種類以上のリン酸化タンパク質用のFACEキットをご用意しております。

詳細はFACE Cell-Based ELISAsのページをご参照ください。

結合部位解析のためのChIP-IT® Express

アクティブ・モティフは、転写因子の結合サイト研究に用られるクロマチン免疫沈降法(ChIP)を簡便に行うため、目的に合わせて選択可能な数種類のChIP-IT Expressキットを提供しています。ChIP-IT Expressは、従来のアガロースに代わりプロテインGをコートした磁気ビーズを利用したことにより、ChIPに大幅な改良をもたらしました。本製品群にはソニケーション法と酵素法のそれぞれに対応した製品をご用意しています。アクティブ・モティフはまた、多くのChIP検証済みの抗体や、Ready-to-ChIPクロマチンも多数提供しており、ChIPを成功へと導きます。

ChIP-IT ExpressおよびクロマチンIP関連の製品に関する詳細はChIP-IT Expressのページをご覧ください。

タンパク質相互作用を検出するUniversal Magnetic Co-IP

アクティブ・モティフのUniversal Magnetic Co-IPキットは、核および全細胞からの共免疫沈降(Co-IP)を可能にします。ChIP-IT Expressと同じく磁気ビーズを用いたプロトコールを利用して、バックグラウンドを大幅に削減しながら、IPおよび洗浄の工程を迅速化・簡略化します。

詳細はUniversal Magnetic Co-IP Kitのページをご覧ください。

Recombinantタンパク質

アクティブ・モティフは、TransAM活性測定ELISAの標準タンパク質として利用可能な検証済みのNFκB p65およびNFκB p50をはじめ、数多くの転写因子や細胞シグナル関連のタンパク質をご用意しています。

リコンビナントタンパク質の全リストはこちらをクリックしてご確認ください。

抗体

アクティブ・モティフで提供しているRel/NFκB、IκBおよびIKKタンパク質などに対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の豊富なラインナップをご確認ください。弊社の抗体の多くは、ChIP、ウェスタンブロッティングまたはEMSAでの使用が検証されています。

抗体の全リストはこちらをクリックしてご確認ください。

細胞抽出物

アクティブ・モティフは、様々な細胞や組織由来の高品質な核、細胞質および全細胞の抽出物を提供しております。弊社が提供する多くの抽出物は、検出の困難な転写因子の活性化を特異的に誘導するよう処理された細胞から調製されています。これらのReady-to-useの抽出物は、TransAM、ゲルシフト、ウェスタンブロッティングを含む様々な用途のポジティブコントロールとしてご利用いただけます。

選択可能な抽出物の多くはNFκB研究において理想的なポジティブコントロールとなります。販売中の製品のリストはこちらをクリックしてください。