ATAC-Seq Express Kit

いいえ、同一ではありません。本キットは、Buenrostro et al., Nat. Methods. 2013 のプロトコルに、Corces et al., Nat. Methods. 2017 による改良を組み合わせたものです。バッファーおよびワークフローは、元の公開手法と比較して、より高い安定性・再現性・効率を実現するように社内で最適化しています。

関連製品： Nextera™-Compatible CDI and UDI Primers (1-96)

詳細はこちら： [Podcast] ATAC-Seq、scATAC-Seq、および単一細胞におけるクロマチンダイナミクス（Jason Buenrostro）
[Podcast] クロマチン構造がアルツハイマー病およびパーキンソン病に与える影響（Ryan Corces）

ATAC-Seq Express Kitは、ATAC-Seq Kit (Cat. No. 53150). とは異なり、1.5 mLチューブから0.2 mLチューブで実施できるようプロトコルを最適化しました。このフォーマット変更により、マルチチャンネルピペットを使用した迅速な洗浄ステップが可能になります。また、ATAC-Seq Express Kitでは、DNA精製にカラムではなくシリカビーズを使用しています。これらの主な違いにより、ワークフロー全体が大幅に高速化されています。

• チューブフォーマット: 0.2 mL (Express) vs. 1.5 mL (Original)
• 実験時間: 洗浄ステップの短縮と移し替え作業の削減
• 精製方法: シリカビーズ (Express) vs. スピンカラム (Original)
• 処理速度: マルチチャンネルピペットおよび自動化装置に対応

関連製品: Original ATAC-Seq Kit (Cat. No. 53150)

本キットに含まれるリコンビナントTn5酵素は、弊社でクローニング、発現、精製、および社内品質テストを実施した高活性変異体です。本酵素は、次世代シーケンシング (NGS) アダプターがあらかじめ組み込まれているため、最適化やその他の準備を行うことなく、そのまま使用できます。

• 酵素：リコンビナント高活性型Tn5変異体
• 製造：社内でクローニング、発現、精製
• 品質管理試験 (QC)：ATAC-Seq性能および活性の再現性について検証済み
• フォーマット：NGSアダプターをロードしたTn5トランスポゼース
• 使いやすさ：酵素へのアダプターローディング作業や最適化ステップが不要

細胞の場合は1000細胞で解析した実績がありますが、推奨量は細胞100,000個です。また、組織の場合は20~30 mgです。(※最小量で解析ができる場合もありますが、推奨するものではありません。)

• 細胞：1反応あたり100,000個の細胞を推奨
• 組織：1反応あたり20 mg以上を推奨
• ポイント：最適な結果を得るために、細胞が健全であること、組織が新鮮であること、適切に凍結保存されていることを確認してください。

はい。凍結細胞および組織も使用可能ですが、ATAC-Seqの成功にはサンプルの品質が非常に重要です。細胞は、氷結晶によるダメージを防ぐため、保護培地を用いた上で、緩慢凍結法により凍結保存してください。組織は、液体窒素や−80℃で急速凍結 (スナップフリーズ) する必要があります。

• 細胞：保護培地を用いて緩慢凍結法により凍結保存する。融解する際は、37℃のウォーターバスで迅速に解凍し、直ちにPBSまたは培地に移してDMSOを希釈する。
• 組織：最適な保存のため、液体窒素や−80℃で急速凍結する。

はい。抽出した核は−80℃で凍結保存し、後日使用することが可能です。また、複数の核サンプルをプールすることで反応あたりの総インプット量を増やすことができ、ライブラリーの複雑性の向上につながる場合があります。

• 保存温度：長期保存には−80℃
• 核のプール：限られた細胞などの場合、複数の抽出した核をプールすることでインプット量を増加させる

はい。FACSでソートした細胞も使用可能ですが、蛍光活性化セルソーティング (FACS) は細胞にダメージやストレスを与える可能性があるため注意が必要です。高品質なATAC-SeqのDNAライブラリー調製には、生存細胞および完全性の保たれた核が重要であるため、穏やかなソーティング条件と最小限の手順であることを推奨します。

• 適用例：ATAC-Seq用のFACSソート細胞
• 注意点：ソーティング過程で細胞が損傷またはストレスを受ける可能性がある
• 推奨事項：再現性の高い結果を得るため、細胞生存率および核の完全性を維持すること

はい。オルガノイドサンプルもATAC-seqに適用可能ですが、タグメンテーション前にMatrigelやその他の細胞外マトリックスを完全に除去する必要があります。残存する細胞外マトリックス (ECM) はTn5酵素活性を強く阻害し、クロマチンアクセシビリティシグナルを低下させます。そのため、ミトコンドリアDNA、バックグラウンドノイズ、およびサンプルロスを最小化するために慎重なサンプル調製が必要です。

• マトリックス除去：核分離前にMatrigelやECMを完全に溶解し洗浄する
• 解離：クロマチンの完全性を維持するため、穏やかな酵素的または機械的手法を使用する
• 核品質：ミトコンドリアDNAおよびデブリを低減するよう分離条件を最適化する
• 凝集：軽度のクランピングは許容されるが、試料の大部分は単一細胞または単一核であることが望ましい
• 生物学的ばらつき：各リプリケートごとに複数のオルガノイドをプールする
• 標準化：サンプル間で継代数および分化段階を揃える

はい。40 µm cell strainer (Corning社 Cat. No. 352340)を推奨します。このストレーナーは均一な単一細胞懸濁液の調製を可能にし、ライブラリー調製を妨げるデブリなどの混入を防ぎます。

• ストレーナーサイズ：40 µm
• 適用例：組織からの単一細胞懸濁液調製
• 利点：DNAライブラリーの安定性した調製および再現性の向上

ほとんどの試薬は室温で解凍可能ですが、Tn5トランスポゼースとQ5 DNAポリメラーゼは除きます。これら2つの成分はグリセロールを含むために解凍する必要はなく、そのまま氷上に置いてください。酵素類以外の試薬は凍結融解が可能なため、16反応すべてを一度に調製する必要はありません。

• 室温で取扱い可能：Tn5トランスポゼースとQ5 DNAポリメラーゼを除くすべての試薬
• 氷上で保持：Tn5トランスポゼースとQ5 DNAポリメラーゼ（グリセロール含有）
• 柔軟性：その他の成分は凍結融解が可能
• 利点：常にフレッシュな状態で使用することが可能

はい。ただし最適な結果を得るためにはThermomixerの使用を推奨します。タグメンテーション反応は、ヒートリッド付きのサーマルサイクラーで37℃にインキュベートすることで、サーモミキサーなしでも実施可能であり、この方法でも良好なライブラリーを得ています。

• 推奨：タグメンテーション中の均一な混合のためサーモミキサーを使用
• 代替方法：ヒートリッド付きサーマルサイクラーで37℃インキュベーション
• 結果：ミキサーなしでも高品質なライブラリーは得られるが、わずかなばらつきが生じる可能性がある

はい。プロトコルの最適化のために追加で購入することが可能です。ATAC-Seq Buffer Set (Cat. No. 53153) には、細胞溶解、タグメンテーション効率、およびミトコンドリア由来リードの低減を含むデータ品質の最適化に寄与する主要試薬が含まれています。

• 含まれるバッファー：Lysis buffer、Tagmentation buffer、Digitonin
• 適用例：プロトコルの最適化およびトラブルシューティング
• 利点：クロマチンアクセシビリティおよびS/N比の向上
• 適合性：Active MotifのATAC-seqワークフロー向けに設計

新鮮な、あるいは最適化されたバッファー条件を使用することで、ATAC-seqのDNAライブラリー調製におけるデータ品質および再現性を大幅に向上させることができます。

ATAC-Seqの場合、DNAライブラリーのフラグメントは、約250 bp〜1000 bpの範囲に分布し、ヌクレオソーム間隔を反映した約150 bp周期のオシレーション (周期的なピーク) が観察されます。適切なライブラリーサイズ分布は、タグメンテーションおよびライブラリー調製が成功していることを示します。

• フラグメントサイズ範囲：250〜1000塩基対
• オシレーション周期：約150 bp（ヌクレオソームパターンを反映）
• 品質確認：Fragment AnalyzerまたはBioanalyzerのトレースで、上記の期待される分布が確認されること
• 参考イメージ：

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ライブラリーQCの詳細はこちら： ［Blog］ATAC-SeqおよびCUT&TagにおけるライブラリーQC

ミトコンドリアリードは、NGSライブラリーにおいて通常、全リードの約20%を占めることが一般的です。ミトコンドリア由来リードが増加するとシーケンス深度が消費され、クロマチンアクセシビリティ解析に使用できる有効データが減少します。50%を超える場合は、一般的にサンプル品質の低下または細胞膜の損傷を示唆します。

• 一般的な割合：全リードの約20%
• 注意閾値：50%以上はサンプル調製不良または細胞損傷の可能性
• 高代謝組織：肝臓、筋肉、および多くのがん細胞では自然に30〜40%となる場合がある
• 透過性制御：バッファー中のジギトニンが細胞膜を選択的に透過化するのに寄与
• シグナル改善：ミトコンドリア由来リードの低減により核由来リードが増加
• 効果：ミトコンドリアコンタミネーションの低減はライブラリー複雑性、アラインメント率、およびピークコール精度の向上につながる

ミトコンドリアコンタミネーションを低く維持することで、データ品質および下流解析の再現性が向上します。

PCRサイクル数を増やしてもATAC-seqデータの品質は向上しません。PCRサイクルを増やすことで見かけ上のDNAライブラリー収量は増加する場合がありますが、同時に増幅バイアス、重複リードの増加、ライブラリー複雑性の低下を引き起こします。シグナル品質は主にサンプルの完全性および効率的なタグメンテーションによって決定されます。

• データ品質：追加のPCRサイクルは有効シグナルを改善しない
• リスク：過剰増幅により重複リードおよびバイアスが増加
• 最適化ポイント：タグメンテーション反応条件
• 重要因子：高品質で完全性の保たれた核または細胞
• 推奨アプローチ：PCR増幅ではなくサンプル調製条件の最適化

最良の結果を得るためには、PCRの過剰サイクルではなく、細胞数、核の品質、細胞透過性、およびタグメンテーションの反応条件に注力することが重要です。

通常、1サンプルあたり3000万リードのペアエンドリードで十分であり、信頼性の高いATAC-Seq結果を得るための最小値は2000万ペアエンドリードです。必要なリード数は、サンプルのゲノムサイズおよび解析の深さによって異なります。

• 推奨リード数：3000万ペアエンドリード
• 最小リード数：2000万ペアエンドリード
• 考慮事項：ゲノムサイズが大きい場合や、より複雑な解析の場合、より深いシーケンスが必要となる可能性がある
• 目的：再現性のあるクロマチンアクセシビリティ解析に十分なカバレッジの確保

ATAC-Seqでは、ペアエンドリード長としてPE50 (PE38、PE42でも) を推奨しています。このリード長は、シーケンス効率とデータ品質のバランスが最適であり、不要なリードの重なりやアダプターの読み込みを最小限に抑えます。

より高い解像度 (ヌクレオソーム位置解析や転写因子フットプリンティングなど) が必要な場合には、PE75やPE100などの長いリード長を使用することも可能ですが、多くのATAC-Seqアプリケーションでは必須ではありません。

ATAC-SeqでのDNAライブラリーのアダプター長は約140 bpであり、平均インサートサイズは約60 bpです。そのため、PE150のような長いリードを使用するとアダプター領域まで読み込んでしまうリスクが高まり、アーティファクトの混入、アライメント品質の低下、および有効データ量の減少を引き起こす可能性があります。

Illuminaラン設定例：

• Read 1：38サイクル
• Index 1 (i7)：8サイクル
• Index 2 (i5)：8サイクル
• Read 2：38サイクル

ATAC-Seq Express キットには、16サンプル用の4×4デュアルインデックスが含まれています。16サンプルを超えてマルチプレックス解析を行う場合は、Nextera™-Compatible CDI and UDI Primers (1-96)を使用することで最大96反応まで対応可能です。これらのプライマーは25 µMで供給され、ATAC-Seq Express Kitとそのまま併用できます。また、同濃度 (25 µM) の他のIllumina Nexteraプライマーを組み合わせることで、さらなるマルチプレックス構成も可能です。

• キット標準：16サンプル (4×4デュアルインデックス)
• 拡張マルチプレックス：Nextera™-Compatible Multiplex Primers (96 plex) kitにより最大96サンプル
• プライマー濃度：25 µM (ATAC-Seqキットでそのまま使用可能)
• 代替方法：同濃度のIllumina Nexteraプライマーを組み合わせてカスタムマルチプレックス可能

関連製品： Nextera™-Compatible Multiplex Primers

ATAC-SeqのDNAライブラリーは、シーケンス前に等モル濃度で0.5〜4 nMにプールする必要があります。最適なプール濃度は、シーケンスプラットフォーム、フローセルの仕様、およびロードプロトコルによって異なります。各システムに応じて、シーケンス機器メーカーの推奨ロード条件に従ってください。

• 推奨範囲：0.5〜4 nM (等モルプール)
• 正規化：プール前に各ライブラリーを正確に定量し、濃度を揃えること
• プラットフォーム依存性：Illumina各機種により最適ロード濃度は異なる場合がある
• 過剰ロードのリスク：クラスター品質の低下および重複リードの増加
• 過少ロードのリスク：シーケンス収量およびデータ多様性の低下

最良の結果を得るためには、qPCRまたは蛍光定量法によりライブラリー濃度を検証し、シーケンスプラットフォームメーカーの推奨ロード濃度に従ってください。

はい。Active Motifでは、DNAライブラリーからのシーケンスサービスを提供しています。ライブラリーQCからシーケンス、データ納品まで、シーケンシングサービスチームが一貫したサポートを行います。 プロジェクトのご相談は、下記の日本法人までご連絡ください。

• サービス内容：DNAライブラリーのシーケンス
• サポート範囲：ライブラリーQC、シーケンス、データ納品
• お問い合わせ先: [email protected]

はい。Active Motifでは、ATAC-Seqデータの解析サービスを提供しています。バイオインフォマティクスおよびシーケンシングサービスチームが、シーケンスの生データから解釈可能な結果の取得まで、一貫したデータ解析サポートを提供します。解析内容についてのご相談は、日本法人までご連絡ください。

• サービス内容：ATAC-Seqデータ解析
• サポート範囲：アライメント、ピークコール、統計解析、比較解析、レポート作成
• <お問い合わせ先：[email protected]